[发明专利]制备cDNA文库的方法

权利要求书

1.制备cDNA文库的方法，包括：

(a)通过逆转录RNA样品或通过使DNA寡核苷酸与RNA样品杂交以产生DNA:RNA杂交体，

(b)用RNA酶H处理DNA:RNA杂交体以产生包含RNA片段的经消化的样品；和

(c)逆转录RNA片段以产生cDNA文库。

2.根据权利要求1所述的方法，其中方法是通过逆转录RNA样品来完成的。

3.根据权利要求1所述的方法，其中DNA:RNA杂交体是通过使DNA寡核苷酸与RNA样品杂交而制备的。

4.根据权利要求3所述的方法，其中DNA寡核苷酸具有随机序列。

5.根据权利要求3所述的方法，其中DNA寡核苷酸是序列特异性的。

6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中样品包含mRNA和/或lncRNA。

7.根据前述任一项权利要求所述的方法，进一步包括对cDNA文库测序以获得对应于至少一些RNA片段的序列测序片段。

8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中：

步骤(a)的RNA样品包含mRNA和小RNA，步骤(a)包括逆转录mRNA而不是小RNA以产生含有小RNA和DNA:mRNA杂交体的第一链cDNA产物；

步骤(b)的经消化的样品含有小RNA和mRNA片段；和

步骤(c)包括逆转录小RNA和mRNA片段以产生cDNA文库，其中cDNA文库包含：i.小RNA的拷贝；和ii.mRNA片段的拷贝。

9.根据权利要求8所述的方法，其中小RNA包括短干扰RNA(siRNA)分子、微RNA(miRNA)分子、小非编码RNA(tncRNA)分子或小调节性RNA(smRNA)分子。

10.根据权利要求8或9所述的方法，进一步包括对cDNA文库测序以获得对应于至少一些mRNA片段的序列测序片段和对应于至少一些小RNA的序列测序片段。

11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中步骤(c)通过以下完成：

(i)向经消化的样品中的RNA分子的3'末端添加尾巴或衔接子；

(ii)将衔接子连接到经消化的样品中的RNA分子的5’末端；和

(iii)使用与添加至RNA分子3'的尾巴或衔接子杂交的引物逆转录加尾的、衔接子连接的RNA，以产生cDNA文库，其中添加步骤(i)和连接步骤(ii)能够以任一顺序进行。

12.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中步骤(a)的逆转录由oligo-dT引物引发。

13.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中步骤(a)的逆转录由序列特异性引物引发。

14.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中方法包括通过PCR扩增cDNA文库。

15.根据权利要求14所述的方法，进一步包括PCR后尺寸选择。

16.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中步骤(a)使用RNA酶H^-逆转录酶完成。

17.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中步骤(a)的逆转录酶活性和步骤(b)的RNA酶H活性由单一酶提供。

18.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中步骤(a)的逆转录酶活性和步骤(b)的RNA酶H活性由不同的酶提供。