[发明专利]使用HBV包膜蛋白的HBV PreS1和/或PreS2和/或S-HBsAg区域的治疗乙型肝炎病毒(HBV)的疫苗

说明书

本发明公开了一种包括CD180结合配体和与其相连的乙型肝炎抗原的组合物及其应用。乙型肝炎抗原包括乙型肝炎病毒包膜蛋白的pre‑S1和/或pre‑S2区域(HBVpreS1/S2Ag)、L‑HBsAg、M‑HBsAg、S‑HBsAg或其抗原片段或突变体。

交叉引用

本申请要求享有2017年11月16日提交的序列号为62/587051的美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用合并于此。

政府权力声明

本发明是在美国国防部高级研究计划局(Defense Advanced Research ProjectsAgency)授予的第HR0011-11-2-0007号拨款的政府支持下进行的，政府对本发明享有一定的权利。

背景技术

尽管有预防性乙型肝炎病毒(HBV)疫苗供应，但在工业化国家和发展中国家，HBV感染仍然是一个非常重大的全球健康问题；它是仅次于烟草的致癌原因。对于慢性乙型肝炎(CHB)患者，治疗性HBV疫苗的需求显然没有得到满足。 10～30％的接种了市场上的HBV疫苗的人，由于遗传因素或不符合性(3次疫苗接种失败)而没有反应。只有37％的接种过一次许可的HBV疫苗的人得到了保护；即使接种了三次疫苗，这是很难实现的，许多人没有有效的反应。目前还没有有效的疫苗来治疗4亿慢性乙肝感染者，包括无症状的乙肝携带者。目前用于治疗慢性乙型肝炎患者的药物存在问题。持续的抗病毒反应很少实现，且目前可用的治疗方法在许多慢性乙型肝炎患者中可能导致病毒抵抗和产生副作用。

附图说明

图1 G28-8LH-scAb-PreS1-S2-His蛋白的方案设计；

图2重组G28-8LH-scAb-PreS1-S2-His的特性研究； G28-8LH-scAb-PreS1-S2-His在CHO细胞中瞬时表达；培养上清通过Ni2+亲和层析柱；用咪唑洗脱结合的G28-8LH-scAb-PreS1-S2-His；洗脱蛋白(E)通过还原 SDS-PAGE和western blotting方法，用anti-6x-His抗体进行表征；

图3重组G28-8LH-scAb-PreS1-S2-His与人B细胞的结合；使用FITC-anti-His 单克隆抗体(粗黑线)直接与人门控CD20+扁桃体B细胞结合；仅限第二步(浅黑线)；

图4重组G28-8LH-scAb-PreS1-S2-His激活人B细胞；富含B细胞的绵羊红细胞结合阴性血液单核细胞在37℃下仅用培养基(浅黑线)或用 G28-8LH-scAb-PreS1-S2-His(粗黑线)孵育24小时；用流式细胞术检测门控样品中的CD20+细胞(太平洋蓝抗CD20)和CD40表达水平，作为活化的指标。图中显示的是门控CD20+B细胞的CD40的表达情况；

图5重组G28-8LH-scAb-PreS1-S2-His重组蛋白(CD180-HBV-preS1/S2)免疫增强猕猴的免疫应答。食蟹猴(Macaca fascularis)组(N＝3)皮下接种：1)300μg G28-8LH-scAb-PreS1-S2(CD180-HBV-PreS1/S2，黑圈)；或2)300μg G28-8LH-scAb-PreS1-S2-His(αCD180-HBV-preS1/S2)加0.5ml Addavax^TM(开放正方形)；动物于第0和30天接种疫苗，并于初次免疫后第0、7、14和30天及二次免疫后第7、14和30天取血清及肝素化血样；(A)ELISA检测HBV-PreS1 特异性IgG抗体水平；每个时间点的平均光密度(O.D.)显示为±SEM。(B)ELIspot 法检测HBsAg特异性的产IFN-γT细胞；在每一个时间点，使用标准差相等的样本进行未配对t检验，评估两组之间每次分析的统计比较；有显著性差异：*P＝0.01， ***P＝0.006。对于所有其它时间点，各组之间的平均反应没有显著差异。