[发明专利]一种提高胎儿血红蛋白表达水平的方法

权利要求书

1.一种体外提高人造血干细胞胎儿血红蛋白(HbF)表达的方法，包括：

通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495219位至第60495336位的BCL11A基因组区域，其中所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9基因编辑技术，其中，所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与SEQ ID NO:4序列完全互补，并且将该SEQ ID NO：4所示的sgRNA导入到所述造血干细胞中以实现对所述BCL11A基因组的编辑。

2.权利要求1的方法，其中所述sgRNA是经过2’-O-甲基和/或核苷酸间3’硫代修饰的。

3.权利要求2的方法，其中所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基修饰。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。

5.权利要求4的方法，其中通过电转方法将sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。

6.权利要求5的方法，其中所述电转条件为200-600V，0.5ms-2ms。

7.一种通过CRISPR/Cas9系统体外高效编辑造血干细胞的方法，包括将SEQ ID NO：4序列所示的sgRNA导入造血干细胞，其中该sgRNA是经过2’-O-甲基和/或核苷酸间3’硫代修饰的。

8.权利要求7的方法，其中将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。

9.权利要求8的方法，其中通过电转方法将sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。

10.权利要求9的方法，其中所述电转条件为200-600V，0.5ms-2ms。

11.通过权利要求1～10中任一项所述的方法得到的造血干细胞。

12.一种通过基因改造使胎儿血红蛋白(HbF)表达升高的人造血干细胞，其中该造血干细胞中第2号染色体第60495219位至第60495336位的BCL11A基因组区域通过基因编辑技术被破坏，其中，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9基因编辑技术，所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与SEQ ID NO:4序列完全互补，并且将该SEQ ID NO：4所示的sgRNA导入到所述造血干细胞中以实现对所述BCL11A基因组的编辑。

13.通过分化培养权利要求11或12所述的造血干细胞获得的、处于成熟红细胞之前的不同分化阶段的前体细胞。

14.通过分化培养权利要求11或12所述的造血干细胞获得的成熟红细胞。

15.一种体外制造通过基因改造使胎儿血红蛋白(HbF)表达升高的成熟红细胞或其前体细胞的方法，该方法包括：

(a)使用权利要求1～10中任一项所述的方法得到基因改造的造血干细胞；

(b)使用造血干细胞红系扩增和分化培养基对所述基因改造的造血干细胞进行造血干细胞红系扩增和分化，

其中，所述造血干细胞红系扩增和分化培养基包括基础培养基，以及生长因子的组合物，其中所述生长因子的组合物包括干细胞生长因子(SCF)；白介素3，(IL-3)和促红细胞生成素(EPO)。

16.根据权利要求15所述的方法，该方法还包括：

使用红系分化脱核培养基进行造血干细胞红系分化脱核，

所述红系分化脱核培养基包含基础培养基、生长因子、以及孕酮受体和糖皮质激素受体的拮抗剂和/或抑制剂。