[发明专利]因子VIII或因子IX基因敲除兔、其制备方法及其用途

说明书

本发明涉及一种因子VIII或因子IX基因敲除兔、其制备方法及其用途；更具体地涉及已通过CRISPR/Cas9系统敲除因子VIII或因子IX基因的转基因兔、其制备方法及其用途。根据本发明，在已经敲除因子VIII和/或因子IX基因的转基因兔中，作为对于血友病发展发挥关键功能的蛋白质的因子VIII和/或因子IX的功能受到抑制，使得所述转基因兔可用于血友病治疗的开发。

【技术领域】

本发明涉及因子VIII或因子IX基因敲除兔、其产生方法及其用途。更具体地，本发明涉及使用CRISPR/Cas9系统敲除因子VIII或因子IX基因的转基因兔、其产生方法及其用途。

【背景技术】

凝血是响应于血管损伤而发生的复杂且必要的过程。这是通过形成血栓来实现的，所述血栓止血并开始修复受损的血管；受损部位被血纤蛋白和血小板(包括血栓)覆盖。所述过程几乎在损伤后立即开始。

凝血过程涉及两种类型的成分：称为“血小板”的细胞成分和称为“凝血因子”的蛋白质成分。血小板立即在受伤部位形成栓塞，这被称为“初级止血”。次级止血是指一种现象，其中血浆中同时出现并称为凝血因子或凝结因子的蛋白质通过复杂的级联过程反应以形成增强血小板栓塞的血纤蛋白束。

次级止血的凝血级联分为两个途径：内源性途径(也称为“接触激活途径”)和外源性途径(也称为“组织因子途径”)。辅因子和调节剂以及许多凝血因子参与保持所述过程的准确性。

例如，蛋白C是凝血调节的主要机制中的必要因子，称为“抗凝途径”。蛋白C的活性形式(激活蛋白C)是丝氨酸蛋白酶，其分解凝血级联的两个因子，即因子Va和VIIIa，所述两个因子当与其他辅因子(蛋白S)缔合时对于凝血酶的大量产生是必要的。这些因子的破坏(分解)负调节所形成的凝血酶的量，从而导致抗凝作用。已知所述蛋白质具有多效生物活性，具体地抗血栓形成活性、抗炎活性、抗凋亡活性和促纤溶活性。

因子IX(以下称为“FIX”)是对于凝血而言必要的丝氨酸蛋白酶。该蛋白质的缺乏导致出血性障碍，称为“乙型血友病”。在凝血过程中，激活的FIX(FIXa)与其激活的辅因子即因子VIIIa(以下称为“FVIIIa”)组合，将特定的底物因子X(以下称为“FX”)转化为激活的因子X(以下称为“FXa”，是因子X的激活的衍生物)。

因子X是凝血级联的另一个必要因子。FX的激活形式(FXa)是能够与其辅因子(凝血因子Va)组合以将凝血酶原激活为凝血酶的唯一的丝氨酸蛋白酶。此外，长期以来一直被认为是被动旁观者的因子X是通过激活其两种主要受体(即蛋白酶激活的受体1(PAR-1)和PAR-2)而直接参与多种细胞类型的成分。最近的发现已经表明，PAR-2是调节凝血与疾病进展之间的联系并在因子X方面和在纤维化疾病(如纤维化、组织重塑和癌症)中发挥重要作用的重要介质(Borensztajn等人,Am J Pathol.2008；172:309-20)。

在负责人体止血的各种凝血因子中，因子VIII的缺乏被称为“甲型血友病”，并且因子IX的缺乏被称为“乙型血友病”。除血管性血友病(von Willebrand disease)外，甲型血友病是世界上最常见的遗传性凝血病，占所有血友病的约80％至85％，并且发病率为5,000至10,000个活产男孩中之一。乙型血友病更为罕见，并且估计为甲型血友病的约1/5。