[发明专利]用于免疫组库测序的组合物和方法

说明书

本公开提供可用于通过来自生物样本的基因组DNA确定和评价免疫组库的方法、组合物、试剂盒和系统。在一方面，靶特异性引物组提供对T细胞受体和/或B细胞受体链序列的有效扩增，其具有相对于所述组库改进的测序精确度和分辨率。确定与所述免疫细胞受体相关联的可变区的核酸序列以有效地描绘生物样本的克隆多样性和/或与生物样本的所述免疫细胞组库相关联的差异。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年11月14日提交的美国临时申请第62/586,129号和2017年9月1日提交的美国临时申请第62/553,688号的优先权和权益。前述申请中的每一个的全部内容以引用的方式并入本文中。

背景技术

适应性免疫应答包含识别抗原的B和T细胞的选择性应答。编码抗体(Ab，在B细胞中)和T细胞受体(TCR，在T细胞中)抗原受体的免疫球蛋白基因包含复杂基因座，其中由于相应可变(V)、多样性(D)和连接(J)基因片段的重组，以及随后的在早期淋巴分化期间的体细胞超突变事件而产生广泛的受体多样性。对于每一种受体的两个亚基链分别发生重组过程，随后的异二聚体配对产生更大的组合多样性。对有助于人免疫受体组库的潜在组合和连接可能性进行的计算已经估计，可能性的数量大大超过个体中外周B或T细胞的总数。参见，例如，Davis等人(1988)《自然(Nature)》334:395-402；Arstila等人(1999)《科学(Science)》286:958-961；van Dongen等人,《白血病(In：Leukemia)》，Henderson等人(编辑)费城(Philadelphia)：WB Saunders Co.,2002,第85-129页。

多年来已经进行了广泛的努力以便改进以高分辨率进行的免疫组库分析。用于特异性检测和监测淋巴细胞的扩增克隆的方法将为表征和分析正常和致病性免疫反应和应答提供重要机会。尽管努力，但有效的高分辨率分析提供挑战。如Sanger测序的低通量技术可提供分辨率，但限于提供广泛捕获整个免疫组库的有效手段。最近在下一代测序(NGS)方面取得的进展提供捕获组库的途径，然而，由于众多相关序列的性质和所述技术引起的序列错误的引入，已证明难以对真实组库进行有效率并且有效的反映。因此，越来越多地寻求用于有效分析大量免疫细胞受体组库的新方法以更好地理解免疫细胞应答、增强诊断能力并设计新的治疗方法。因此，仍然需要能够解析高度可变的免疫细胞受体序列的复杂群体的改进的测序方法和工作流程。

发明内容

在本发明的一个方面，提供用于单流确定在生物样本中的免疫组库活性的方法。这类方法包含执行具有来自含有靶免疫细胞受体基因组DNA的生物样本的重排V(D)J基因的多个靶免疫受体基因组DNA序列的多重扩增。在一些实施例中，扩增包括使用包含i)和ii)的至少一组引物接触包含目标的多个靶序列的基因组DNA样本的至少一部分，其中i)包含针对至少一个免疫受体编码序列的大多数不同V基因的多个V基因靶特异性引物，并且ii)包含针对相应靶免疫受体编码序列的大多数不同J基因的多个J基因引物。每组引物i)和ii)针对相同靶免疫受体编码序列，其中每个靶免疫受体选自T细胞受体或抗体受体序列，并且使用每一个或多个组进行扩增产生扩增子序列，其代表目标的样本中相应(一种或多种)免疫受体的全部组库序列。在某些实施例中，方法包含扩增包含在样本中免疫受体组库重排V(D)J基因核酸序列的基因组DNA，扩增包含在扩增条件下在聚合酶存在下进行多重扩增反应，以产生包含具有重排的可变、多样性和连接(VDJ)基因片段的一种或多种目标的免疫受体或具有可变和连接(VJ)基因片段的一种或多种目标的免疫受体的多个扩增的靶表达序列。

在一些实施例中，用于扩增样本中的免疫受体组库的重排的基因组DNA序列的方法包含使用至少一组以下各项进行单一多重扩增反应以扩增靶免疫受体DNA模板分子：

i)(a)多个V基因引物，其针对至少一个免疫受体编码序列的大多数不同V基因，所述免疫受体编码序列包含处于V基因内的框架区3(FR3)的至少一部分，