[发明专利]用于免疫组库测序的组合物和方法

权利要求书

1.一种用于扩增样本中的免疫受体组库的重排的基因组DNA序列的方法，其包含：

使用至少一组以下各项进行单一多重扩增反应，以扩增具有重排的VDJ或VJ基因片段的靶免疫受体DNA模板分子：

i)(a)多个V基因引物，其针对至少一个免疫受体编码序列的大多数不同V基因，所述免疫受体编码序列包含处于所述V基因内的框架区3(FR3)的至少一部分，

(b)多个V基因引物，其针对至少一个免疫受体编码序列的大多数不同V基因，所述免疫受体编码序列包含处于所述V基因内的框架区2(FR2)的至少一部分，或

(c)多个V基因引物，其针对至少一个免疫受体编码序列的大多数不同V基因，所述免疫受体编码序列包含处于所述V基因内的框架区1(FR1)的至少一部分；和

ii)多个J基因引物，其针对所述至少一个免疫受体编码序列的大多数不同J基因的至少一部分，

其中每组i)和ii)引物针对选自T细胞受体基因或抗体受体基因的相同靶免疫受体基因的编码序列，并且其中使用所述至少一组i)和ii)引物进行所述扩增产生代表所述样本中所述靶免疫受体组库的扩增子分子；

从而产生包含所述靶免疫受体组库的免疫受体扩增子分子。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个V基因引物和/或所述多个J基因引物中的每一个具有以下标准中的任何一个或多个：

(1)在所述引物序列内包括两个或更多个修饰的核苷酸，其中至少一个包括在所述引物的末端附近或末端处，并且其中至少一个包括在所述引物序列的中心核苷酸位置处或其周围；

(2)长度为约15到约40个碱基；

(3)Tm为高于60℃到约70℃；

(4)与在所述样本中存在的非靶序列的交叉反应性低；

(5)至少前四个核苷酸(从3'到5'方向)与在同一反应中存在的任何其它引物内的任何序列不互补；和

(6)与在任何其它产生的靶扩增子内的至少5个核苷酸的任何连续区段不互补。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述多个V基因引物和/或所述多个J基因引物中的每一个包括一个或多个可裂解基团，所述可裂解基因优选地位于(i)所述引物的末端附近或末端处或(ii)所述引物的所述中心核苷酸附近或周围。

4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述多个V基因引物和/或所述多个J基因引物中的每一个包括具有选自以下的可裂解基团的两个或更多个修饰的核苷酸：甲基鸟嘌呤、8-氧代-鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶二聚体、7-甲基鸟苷、8-氧代-脱氧鸟苷、黄嘌呤核苷、肌苷、二氢尿苷、溴脱氧尿苷、尿苷或5-甲基胞苷。

5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述至少一组i)和ii)为i)(a)和ii)，其中所述多个V基因引物与所述模板分子的所述FR3区的至少一部分粘接，并且其中所述多个J基因引物包含至少十种与所述模板分子的所述J基因部分的至少一部分粘接的引物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所生成的免疫受体扩增子分子包括免疫受体基因序列的互补决定区CDR3。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述扩增子的长度为约70到约100个核苷酸。

8.根据权利要求5所述的方法，其中所述扩增子的长度为约80到约90个核苷酸。

9.根据权利要求5所述的方法，其中所述多个V基因引物针对在长度为约50个核苷酸的FR3区上的序列。

10.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一组i)和ii)选自表3和表5的所述引物。

11.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一组i)和ii)包含选自SEQ ID NO:185-248和313-397或选自SEQ ID NO:185-248和398-482的引物。