[发明专利]对病毒生产有效载荷具有低毒性的经修饰的EC7细胞

说明书

设想了允许快速和高滴度产生重组病毒、尤其是复制缺陷型Ad5病毒的重组细胞及其方法。在一些优选的方面，宿主细胞经修饰以产生降低或消除在病毒中所编码的治疗性蛋白质的表达的抑制剂，而在其他方面，该病毒包括直接或间接降低或消除在该病毒中所编码的治疗性蛋白质的表达的基因。最优选地，由该宿主细胞编码的shRNA将降低或抑制在重组病毒中所编码的有效载荷基因的表达。

本申请要求2017年10月10日提交的序列号为62/570,508和2108年2月21日提交的序列号为62/633,412的我们的共同未决的美国临时专利申请的优先权，将二者均通过引用并入本文。

技术领域

本发明的领域是重组细胞，并且尤其是用于产生用于癌症疫苗的治疗性重组病毒的经修饰的哺乳动物细胞。

背景技术

背景描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。

本文中的所有出版物均通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地指示通过引用并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。

使用病毒作为重组治疗性蛋白质的递送系统以及在哺乳动物细胞中产生蛋白质的基因疗法在本领域中已变得越来越被接受。尽管至少在概念上相对简单，但仍遇到各种困难，并且大多数问题与病毒-宿主相互作用有关。

例如，腺病毒是充分表征的dsDNA病毒，并且通常允许产生含有各种转基因的腺病毒粒子，以递送至许多目的细胞类型。在这方面，5型腺病毒代表了研究最深入的平台之一，其中在商业领域有大量试剂盒可用于产生经使用者确定的病毒。以这种方式产生的5型腺病毒已用于细胞培养、动物试验以及甚至临床试验中，这进一步支持科学及临床实践者对此系统的熟悉。认为病毒进入细胞是经由柯萨奇病毒及腺病毒受体(CXADR)介导的。因此，在未能产生CXADR的细胞或组织的此类细胞中使用5型腺病毒技术受到限制，并因此阻碍了许多临床相关细胞和组织(包括干细胞和免疫细胞)的转导。

CXADR(Swiss-Prot登录号：P78310)是I型膜受体，并且是免疫球蛋白超家族的成员(Science[科学](1997)275；1320-1323)。CXADR具有通常大于200个氨基酸大小的细胞外结构域，并且被认为是对于紧密连接完整性必不可少的上皮顶部连接复合物的组分(JBiol Chem[生物化学杂志](1999)274；10219-10226)。CXADR可以在宿主细胞中过表达，从而获得AD5病毒的进入途径。尽管此类重组细胞对Ad5转染敏感并可能提高蛋白质的产生，但此类系统仍将存在各种缺陷。最值得注意的是，如果将病毒用作治疗性实体，则足够数量的重组病毒(例如，10¹⁰-10¹²个病毒粒子)的产生通常是不一致的，并且在一些情况下甚至是无法实现的。

例如，先前已经报道了对于一些腺相关病毒，通过调节腺相关病毒的REP和CAP蛋白的表达提高病毒滴度，如US 6548286、WO 98/46728或US 2004/0043490中所报道的。然而，由于腺相关病毒的REP和CAP蛋白的特异性以及这种病毒的生命周期，此类系统通常不会转化到其他病毒系统。在另一种方法中，如果在生产细胞中从重组核酸产生蛋白质是由在CHO细胞中表达的重组基因驱动的，则在合成siRNA的存在下培养细胞以抑制重组蛋白的表达，并且之后在不存在siRNA的情况下培养细胞以允许产生所需重组蛋白，如US 8273722中所披露的。然而，尽管此类系统至少在一定程度上增加了所需重组蛋白的数量，但是在所述CHO细胞中产生高滴度的重组病毒既无法设想又甚至不可行。

因此，尽管在本领域中已知许多细胞生产系统和病毒载体，但仍需要以简单有效的方式产生高滴度重组病毒并且尤其是治疗性病毒的系统和方法。

发明内容