[发明专利]用于增加蛋白产量的细胞系和方法

说明书

本技术总体上涉及用于增加各种细胞系中的重组蛋白产量的方法。在实施例中，对ULK1基因的作用进行削弱，从而使细胞系的蛋白产量增加。还提供了具有增加的蛋白产量的细胞系，以及制备此类细胞系的方法。

序列表

本申请含有已经以ASCII格式以电子方式提交且特此通过引用以其全文并入的序列表。所述ASCII副本创建于2018年9月28日，名称为0098-0001WO1_SL.txt，大小为17,225字节。

技术领域

本技术总体上涉及用于增加各种细胞系中的重组蛋白产量的方法。在实施例中，对ULK1基因的作用进行削弱，从而使细胞系的蛋白产量增加。还提供了具有增加的蛋白产量的细胞系，以及制备此类细胞系的方法。

背景技术

随着生物药物在医学中变得越来越重要，需要从各种细胞类型(包括真核细胞，例如哺乳动物细胞)来提供增加的治疗性蛋白的收率。这还涉及对高且稳定表达的重组细胞系，特别是哺乳动物细胞系的需求。

用于制备治疗性蛋白的重组细胞克隆的产生通常需要广泛筛选各个克隆以检测和分离高表达的克隆。然而，即使在筛选方法的过程中鉴定出高表达的克隆，这些最初高表达的克隆常常也会随着时间的推移失去其有利的表达特性，并且表达收率随着时间的推移而降低。因此，必须加以关注以便在一群成功表达的细胞中鉴定出那些在长期培养期间也具有高产生稳定性并因此不易逐渐丧失重组蛋白表达的细胞。因此，用于大规模制备治疗性蛋白和其他重组多肽的重组细胞克隆的产生通常包括对各个克隆进行过度且费时的筛选，以便鉴定高表达的细胞克隆，这些克隆也显示出大规模产生所必需的表达稳定性。

因此，需要一种从各种细胞系产生大量重组蛋白的方法，以及产生此类细胞系的方法。

发明内容

鉴于前述内容，本文提供了用于削弱基因(包括ULK1基因)的作用的方法，这种削弱可转化为蛋白产量的增加。还提供了用于制备细胞系以增加蛋白产量的方法，以及用于鉴定可以被削弱并因此使蛋白产量增加的基因的方法。

本文的实施例涉及其中ULK1基因的表达产物的作用受到削弱的分离的细胞。

示例性细胞包括真核细胞，包括哺乳动物细胞，例如人胚肾(HEK)细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

在实施例中，通过突变或编辑分离的细胞中的ULK1基因来削弱ULK1基因的表达产物的作用。合适地，突变或编辑消除了或削弱了ULK1基因的表达产物的一个或多个催化残基，或经翻译后修饰的ULK1基因的表达产物的一个或多个残基。在另外的实施例中，突变或编辑减少了细胞中ULK1基因的表达或敲除了ULK1基因。

在进一步的实施例中，通过转录后基因干扰来削弱ULK1基因的表达产物的作用，该转录后基因干扰可包括siRNA干扰、微RNA干扰、反义RNA干扰或小分子干扰。

在实施例中，与其中ULK1基因的表达产物的作用未受到削弱的细胞相比，ULK1基因的表达产物的作用的削弱会导致重组蛋白产量的增加。合适地，重组蛋白的产量增加至少约30％，并且在其他实施例中，重组蛋白的产量增加约50％至约500％。

合适地，重组蛋白是分泌蛋白、膜锚定蛋白或细胞内蛋白。在实施例中，重组蛋白是抗体。

本文还提供了产生重组蛋白的方法。此类方法包括将编码重组蛋白的重组基因引入其中ULK1基因的表达产物的作用已受到削弱的分离的细胞中。在允许重组蛋白表达的条件下培养分离的细胞。然后如果重组蛋白是由分离的细胞分泌的，则从分离的细胞或从培养基中分离重组蛋白。

还提供了产生用于重组蛋白制备的分离的细胞的方法，这些方法包括削弱分离的细胞中ULK1基因的表达产物的作用，以及在允许分离的细胞扩增的条件下培养分离的细胞。