[发明专利]确定样品中完整微生物的浓度的方法

说明书

本发明涉及一种确定样品中完整微生物的浓度的方法以及设备、消耗物和试剂盒，该方法包括：任选地稀释样品的等分试样以提供处于稀释值的稀释等分试样；使该样品的等分试样或稀释等分试样的至少一部分与能够结合DNA的第一和第二染色剂接触，其中第一染色剂是荧光染色剂，是可渗透细胞的，并具有第一发射波长，并且第二染色剂是不可渗透细胞的，并能够在FRET对中充当受体分子，而所述第一染色剂充当供体分子；在第一发射波长下对等分试样‑染色剂混合物成像，并确定与成像的混合物中的完整微生物相对应的对象的数量的图像分析值；并将所述等分试样的图像分析值与预定校准曲线进行比较。

本发明总体上涉及样品中微生物的检测和表征。特别地，本发明提供了一种用于测量样品中完整微生物的浓度的快速方法。特别地，完整微生物是活的。

传统上，样品中微生物的生长和微生物的浓度是通过测量样品的光学参数(例如浊度)来确定的。例如，McFarland标准品在微生物学中用作样品浊度的参考，使得样品中的微生物(通常是细菌)的数量将处于给定的浊度范围内，并且此类标准品可用于浊度计中以确定样品中微生物的浓度。可以使用包括分光光度法的替代技术来确定样品中微生物的浓度。然而，尽管快速且容易实施，但这种技术仅能够估计样品中的微生物数量。浊度或特定波长的光的吸光度与样品中微生物浓度之间的关系也随不同的微生物种类而变化，因此当不清楚所讨论的微生物的类别时，很难估计微生物的浓度。此外，此类技术仅能够测量样品的总浊度或吸光度，因此无法区分样品中的活细胞(即有生命的细胞)和非活细胞(即死细胞)，或者实际上无法区分样品中的完整微生物或细胞或其他碎片。浊度测量样品中微生物的浓度也具有低灵敏度，并且为了能够测量样品中微生物的浓度，需要相对较高的微生物浓度。这种情况阻碍了以这种方式测量低浓度，并且在进行测量之前可能还需要延长培养步骤。

还可以通过将样品的一部分(或稀释的一部分)铺在固体生长培养基上，孵育样品并计数形成的菌落数量来更定量地估计样品中的活微生物的数量。然而，这种技术的缺点在于，它需要漫长的孵育步骤，以便有足够的时间进行微生物的生长。因此，这样的经典技术可用于在特定的时间点测量样品中微生物的浓度，但是在需要迅速获知微生物的浓度的情况下用途有限，例如对需要事先了解样品中存在的微生物数量的样品中的微生物进行测试或确定。

在微生物检测领域中众所周知，活的(即有生命的)细胞也可以与死细胞区分开，并且许多技术可用于此目的。本领域已知的方法集中于核酸染色剂、膜电位、氧化还原指示剂或报告基因。通常，这些技术依赖于以下事实：活微生物的膜完好无损，而死亡微生物的膜则被破坏和/或破裂(Gregori等,2001.Appl.Environ.Microbiol.67,4662-4670)。