[发明专利]确定样品中完整微生物的浓度的方法

权利要求书

1.一种确定样品中完整微生物的浓度的方法，所述方法包括：

a.提供含有微生物的样品；

b.任选地稀释所述样品的等分试样以提供处于稀释值的稀释等分试样；

c.使步骤(a)的所述样品的等分试样的至少一部分或在稀释步骤(b)期间或之后的所述样品的稀释等分试样的至少一部分与能够结合DNA的第一和第二染色剂接触以提供样品-染色剂混合物，其中所述第一染色剂是荧光染色剂，是可渗透细胞的，并具有第一发射波长，并且所述第二染色剂是不可渗透细胞的，并且能够在FRET对中充当受体分子，而所述第一染色剂充当供体分子；

d.在所述第一发射波长下对步骤(c)的等分试样-染色剂混合物进行成像，并确定与成像的混合物中的完整微生物对应的对象的数量的图像分析值；以及

e.将所述等分试样的所述图像分析值与预定校准曲线进行比较，从而确定所述样品中完整微生物的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述样品的等分试样稀释以提供处于稀释值的稀释等分试样，其中接触步骤(c)在稀释步骤(b)期间或之后进行，并且其中步骤(c)-(e)在所述稀释等分试样上进行。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述方法包括稀释所述样品的等分试样以提供处于不同稀释值的两个或更多个稀释等分试样，其中，所述两个或更多个等分试样在步骤(c)之前或期间同时制备，或者依次进行制备，其中在步骤(d)和/或(e)之后制备第二或进一步的稀释等分试样。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，在处于不同稀释值的两个或更多个等分试样上进行步骤(c)和(d)，并且其中步骤(e)包括鉴定包括在预定校准曲线的范围内的图像分析值的等分试样，并将所述等分试样的图像分析值与所述预定校准曲线进行比较，从而确定所述样品中的活微生物的浓度。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤(c)和(d)在每个等分试样上同时进行。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤(c)和(d)在每个等分试样上依次进行。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述第二染色剂具有比所述第一染色剂更高的DNA结合亲和力，使得所述第二染色剂能够从DNA上置换所述第一染色剂。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述方法不包括检测所述第二染色剂。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述方法包括检测所述第二染色剂。

10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(d)包括对每个等分试样-染色剂混合物同时成像以检测所述第一和第二染色剂。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述样品包括包含在生长培养基中的微生物。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)中接触所述样品的等分试样或所述样品的稀释等分试样或其一部分之前，将所述第一和第二染色剂预混合以形成染色液。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述第一荧光染色剂在所述第一发射波长处的荧光强度在所述染色剂与核酸结合时被增强。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述第一荧光染色剂具有在350-700nm的波长范围内的激发波长和发射波长。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，所述第一荧光染色剂是绿色荧光染色剂。