[发明专利]用于微生物裂解的半干珠磨方法及进行该方法的装置

说明书

公开了用于裂解细胞以释放提取物基因组(gDNA)的方法和装置。该方法使用微玻璃珠和细胞(例如孢子)的混合物，该混合物在珠磨裂解过程中形成紧贴于较大的金属球和管侧面的半干饼，大大提高了珠磨过程的效率。装置产生混沌运动，确保产生足够的力来打开细胞，并且金属球冲击遍及分布于容器的内表面，使得所有的细胞混合物均经受充分的冲击，以破坏细胞。结果是，孢子和其他难以裂解的微生物可以在数秒内打开。该方法通过快速打开难以裂解的细胞，减少了步骤的数目和操作时间，同时还保持了DNA的完整性。

技术领域

公开了裂解细胞以从细胞内部释放或提取基因组DNA(gDNA)的方法和装置。公开的方法使用微玻璃珠和细胞(例如孢子)的混合物，该混合物在珠磨裂解(bead beatinglysis)过程中形成紧贴于较大的金属球和管侧面的半干饼，大大提高了珠磨过程的效率。由于细胞在玻璃珠和金属球上成饼，每一次球撞击容器侧面时，细胞都受到冲击。该装置设计成产生混沌运动(chaotic motion)是出于双重目的，第一是确保产生足够的力以打开细胞，第二是使金属球冲击遍及分布于容器的内表面，使得所有的细胞混合物均经受充分的冲击，以破坏细胞。结果是，通常需要煮沸或打磨多达30分钟才能实现充分裂解的孢子和其他微生物，使用本发明公开的半干珠磨方法可以在数秒内打开。该方法通过快速打开难以裂解的细胞，减少了步骤的数目和操作时间，同时还保持了DNA的完整性。

背景技术

许多基于细胞的或基于DNA的分析方法都要求从细胞内部释放包括DNA在内的细胞内含物，以便于分析。打开细胞以释放内含物被称作“裂解”。例如，使用DNA测序技术研究微生物组的方法首先要求裂解微生物以便可以提取DNA。大多数微生物组是细菌、古生菌和真菌的群体，它们对裂解技术的敏感性方面差异巨大。差异敏感性为微生物种群研究者提出了重大问题，研究者希望确保最难裂解的细菌(通常呈革兰氏阳性)和最容易裂解的细菌(通常呈革兰氏阴性)与其原始样品中的种群成比例。令人遗憾的是，大多数微生物裂解方案对于一些微生物效果良好，但对其他则效果很差。(微生物组裂解技术的比较-SanqingYuan,Dora B.Cohen,Jacques Ravel,Zaid Abdo,Larry J.Forney.Evaluation ofMethods for the Extraction and Purification of DNA from the HumanMicrobiome.PLoS ONE 7(3):e33865.doi:10.1371/journal.pone.0033865；另外，用于回收质粒DNA的快速简单的碱裂解技术还会除去微生物基因组DNA，而该基因组DNA是微生物组筛选的靶标(碱裂解打开细胞但除去gDNA-Birnboim,H.C.and Doly,J.,A rapidalkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA,NucleicAcids Res.7(6),1979,1513-1524；相反，KOH裂解可以用于回收细菌基因组DNARaghunathan,Arumugham et al.“Genomic DNA Amplification from a SingleBacterium.”Applied and Environmental Microbiology 71.6(2005):3342–3347.PMC.Web.29Sept.2016)。现有技术中已知有多种裂解技术可基于不同的生化方法破坏细胞完整性，这些方法包括溶菌酶(酶促破坏肽聚糖细胞壁)、强碱(化学破坏)、去垢剂(溶解细胞膜)、珠磨或振荡(机械破坏)和热DNA提取方法，不同的方法会影响微生物组分析结果：Wagner Mackenzie B,Waite DW,Taylor MW.Evaluating variation in human gutmicrobiota profiles due to DNA extraction method and inter-subjectdifferences.Frontiers in Microbiology.2015；6:130.doi:10.3389/fmicb.2015.00130)。大多数公开或市售的DNA制备方法使用这些方法中的一种或多种来裂解细胞，通常以连续的步骤进行，会花费大量的时间，特别是在同时处理许多样品时。尽管单独的裂解方法对于那些不完全或部分裂解就能产生足够的DNA用于所进行方案的应用来说通常是足够的，但它们通常无法与原始群落成比例地由微生物组样品产生DNA，并且可能不能完全裂解某些微生物。例如，基于去垢剂的裂解可以破坏具有弱细胞壁和强细胞膜的细胞亚集，但不能打开具有强细胞壁的去垢剂抗性微生物，导致来自去垢剂抗性细胞的DNA在产生的DNA制剂中比例较低或不存在。在另一实例中，足以裂解具有强细胞膜的细胞的微生物珠磨可能剪切或破坏在该过程早期从容易裂解的细胞中释放的DNA。另外，各种裂解方法往往彼此不相容，如果组合使用的话需要依序进行。例如，溶菌酶在去垢剂或强碱的存在下将会无法起效。某些去垢剂在强碱的存在下会沉淀。珠磨很难与加热处理组合使用。尽管通过连续进行单独的裂解方案可以克服单个方案的缺点，但这增加了复杂性、所涉时间和成本。重要的是，裂解之后必须除去去垢剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)，因为SDS干扰下游的DNA操作。另外，某些微生物可能耐受依序进行的裂解方法，其取决于方案的顺序。例如，某些具有坚固肽聚糖细胞壁的微生物可能具有保护其不被强碱或溶菌酶初始处理破坏的脂质双层外包膜。同时组合使用多种方法可能是有效的，或者连续进行许多个步骤，以便从样品中的全部微生物中产生DNA，但是使用单一方法打开所有细胞将会是显著的改进。