[发明专利]蛋白质纯化方法

说明书

本发明涉及通过使用三色谱柱过程，包括在含羟基磷灰石和/或氟磷灰石的材料上进行的色谱法，从包含蛋白质和杂质的样品中纯化所述蛋白质的方法，所述蛋白质例如是Fc融合蛋白或抗体。本发明还涉及包含可通过本发明方法获得的纯化蛋白质的药物组合物。

发明领域

本发明涉及通过使用三色谱柱过程，包括在含羟基磷灰石和/或氟磷灰石的材料上进行的色谱法，从包含所述蛋白质和杂质的样品中纯化所述蛋白质的方法，所述蛋白质例如是Fc融合蛋白或抗体。本发明还涉及包含可通过本发明方法获得的纯化蛋白质的药物组合物。

发明背景

当生产蛋白质(例如融合蛋白或抗体)用于治疗用途时，重要的是去除过程相关的杂质，因为它们可能是有毒的。过程相关的杂质通常包括HCP(宿主细胞蛋白)、DNA和rPA(残留蛋白A)。HCP是杂质的重要来源，由于它们在分子质量、等电点和结构上的高度复杂性和异质性，可能代表着严峻的挑战。因此，必须使治疗性蛋白质表现出非常低水平的HCP：应特别强调优化在下游工艺(即纯化工艺)中减少HCP的技术。此外，下游工艺必须以符合相应上游工艺产生的质量的方式进行调整。对于任何种类的治疗性蛋白质，还必须将与产品相关的杂质(例如聚集体或蛋白质片段)降低到最低水平。

对于那些愿意生产生物仿制药的人，还有一个额外的因素需要考虑：电荷变体。实际上，酸性和碱性电荷变体的含量必须位于参考产品定义的生物仿制药范畴(corridor)之内。考虑到上游和下游工艺均可改电荷变体，因此下游工艺必须适应这一挑战。

另外，对于任何种类的治疗性蛋白质，纯化应最大程度减少与过程相关的蛋白质损失，并在每个过程步骤中达到可接受的产量。

需要找到最佳的纯化顺序，以保证根据质量标准对产物和工艺相关杂质的整体清除，同时将由于纯化过程引起的蛋白质损失降至最低。

发明内容

在一个方面，本发明提供了一种从包含蛋白质和杂质的样品中纯化蛋白质的方法，所述蛋白质为例如Fc融合蛋白或抗体，其中该方法包括以下步骤：(a)使含有蛋白质和杂质的样品与蛋白A色谱材料(树脂或膜)在一定条件下接触，使得蛋白质与色谱材料结合且至少一部分杂质不与色谱材料结合；(b)从蛋白A色谱材料中洗脱蛋白质，以获得洗脱液；(c)在一定条件下将步骤(b)的洗脱液加载到第一混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得蛋白质不与色谱材料结合且至少一部分剩余杂质与色谱材料结合；(d)在一定条件下回收含有蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液包含比步骤(b)的洗脱液更低水平的杂质；(e)在一定条件下将步骤(d)的含有蛋白质的回收的流通液加载到第二混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得蛋白质不与色谱材料结合且至少一部分剩余杂质与色谱材料结合；和(f)在一定条件下回收含有蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液含有比步骤(d)的回收的流通液更低水平的杂质。

另一方面，本发明还提供一种获得单体形式蛋白质的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)使含有单体形式、聚集形式或片段形式的蛋白质的样品与蛋白A色谱材料(树脂或膜)在一定条件下接触，使得单体形式的蛋白质与色谱材料结合且至少一部分聚集形式和片段形式的蛋白质不与色谱材料结合；(b)从蛋白A色谱材料中洗脱单体形式的蛋白质，以获得洗脱液；(c)在一定条件下将步骤(b)的洗脱液加载到第一混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得单体形式的蛋白质不与色谱材料结合且至少一部分剩余的聚集形式和片段形式的蛋白质与色谱材料结合；(d)在一定条件下回收含有单体形式的蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液含有比步骤(b)的洗脱液更低水平的聚集形式和片段形式的蛋白质；(e)在一定条件下将步骤(d)的含有单体形式的蛋白质的回收的流通液加载到第二混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得单体形式的蛋白质不与色谱材料结合且至少一部分剩余的聚集形式和片段形式的蛋白质与色谱材料结合；和(f)在一定条件下回收含有单体形式的蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液含有比步骤(d)的回收的流通液更低水平的聚集形式和片段形式的蛋白质。