[发明专利]蛋白质纯化方法

权利要求书

1.一种从含有蛋白质和杂质的样品中纯化蛋白质的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(a)使所述含有蛋白质和杂质的样品与蛋白A色谱材料(树脂或膜)在一些条件下接触，使得蛋白质与色谱材料结合且至少一部分杂质不与色谱材料结合；

(b)从蛋白A色谱材料中洗脱蛋白质，以获得洗脱液；

(c)在一些条件下将步骤(b)的洗脱液加载到第一混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得蛋白质不与该色谱材料结合且至少一部分剩余杂质与该色谱材料结合；

(d)在一些条件下回收含有蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液包含比步骤(b)的洗脱液更低水平的杂质；

(e)在一些条件下将步骤(d)的含有蛋白质的回收的流通液加载到第二混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得蛋白质不与色谱材料结合且至少一部分剩余杂质与色谱材料结合；和

(f)在一些条件下回收含有蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液含有比步骤(d)的回收的流通液更低水平的杂质。

2.一种获得单体形式的蛋白质的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(a)使含有单体形式、聚集形式或片段形式的蛋白质的样品与蛋白A色谱材料(树脂或膜)在一些条件下接触，使得单体形式的蛋白质与该色谱材料结合且至少一部分聚集形式和片段形式的蛋白质不与该色谱材料结合；

(b)从蛋白A色谱材料中洗脱单体形式的蛋白质，以获得洗脱液；

(c)在一些条件下将步骤(b)的洗脱液加载到第一混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得单体形式的蛋白质不与该色谱材料结合且至少一部分剩余的聚集形式和片段形式的蛋白质与该色谱材料结合；

(d)在一些条件下回收含有单体形式的蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液含有比步骤(b)的洗脱液更低水平的聚集形式和片段形式的蛋白质；

(e)在一些条件下将步骤(d)的含有单体形式的蛋白质的回收的流通液加载到第二混合模式色谱材料(树脂或膜)上，使得单体形式的蛋白质不与该色谱材料结合且至少一部分剩余的聚集形式和片段形式的蛋白质与该色谱材料结合；和

(f)在一些条件下回收含有单体形式的蛋白质的流通液，使得所述回收的流通液含有比步骤(d)的回收的流通液更低水平的聚集形式和片段形式的蛋白质。

3.如利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述蛋白质是Fc融合蛋白或抗体。

4.如前述权利要求中任一项的方法，其中，所述蛋白质是在重组哺乳动物细胞中产生的。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(c)或(e)的混合模式色谱材料呈现以下功能中的两种或更多种的组合：阳离子交换、阴离子交换、疏水相互作用、亲水相互作用、氢键结合、π-π键结合和金属亲和作用。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(c)的混合模式色谱材料选自下组：Capto-MMC和Capto-Adhere，并且步骤(e)的混合模式色谱材料选自下组：基于羟基磷灰石的配体、基于羟基氟磷灰石的配体或基于氟磷灰石的配体。

7.如权利要求6所述的方法，其中，步骤(e)的混合模式色谱材料是CFTI型或CFTII型的氟磷灰石配体。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，将要在步骤a)中与蛋白A色谱材料接触的包含蛋白质的样品是水溶液的形式。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)之前，用缓冲水溶液平衡蛋白A色谱材料，所述缓冲水溶液包含20-30mM的磷酸钠，浓度为100-200mM的盐，并且pH值在6.5至约7.5的范围内。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，用洗脱缓冲液进行步骤(b)的洗脱，所述洗脱缓冲液包含40至70mM的乙酸，并且pH在3.0至约3.5的范围内。