[发明专利]制备细胞外囊泡的流体系统及相关方法

说明书

本发明涉及一种用于由生产细胞制备细胞外囊泡的流体系统，其包括至少一个容器、被容器包含的液体培养基和生产细胞，其特征在于流体系统还包括悬浮在液体培养基中的微载体和液体培养基的搅拌器，大部分生产细胞黏附在微载体的表面上，搅拌器以及容器的尺寸能够在容器中控制液体培养基的湍流。

技术领域

本发明涉及一种用于从生产细胞制备细胞外囊泡的系统、一种制备和回收这种囊泡的方法、以及通过这种系统制备的囊泡，例如用于细胞疗法和再生医学。

现有技术

已知细胞将细胞外囊泡释放到它们的环境中，例如在体内释放到生物体的生物流体中。细胞外囊泡已被确认为以个性化或靶向的方式向人体递送药物的有效手段。首先，它们具有天然的生物相容性和免疫耐受性。它们还可以包含诊疗一体化的纳米颗粒，其可以使身体的某些部位成像，也可以递送具有治疗功能的活性成分。细胞外囊泡还具有细胞间通讯功能：例如，它们使得在不同细胞之间能够转运脂质、膜和细胞质蛋白和/或细胞质核苷酸例如mRNA、microRNA或长的非编码RNA。

特别地，细胞外囊泡的使用可以解决细胞在治疗用途期间的已知问题，例如细胞复制、分化、血管闭塞、排斥反应的风险以及储存和冷冻的困难。因此，工业上需要制备足量的细胞囊泡以用于治疗用途，特别是作为细胞疗法的替代或补充。

为此，Piffoux等人(Piffoux,M.,Silva,A.K.,Lugagne,J.B.,Hersen,P.,Wilhelm,C.,Gazeau,F.,2017,Extracellular Vesicle Production Loaded withNanoparticles and Drugs in a Trade-off between Loading,Yield and Purity:Towards a Personalized Drug Delivery System,Advanced Biosystems)描述了制备细胞外囊泡的不同方法的比较。

第一种方法包括通过使脐带静脉内皮细胞(HUVEC)受到流体动力学应力，该应力模拟在毛细血管内的生理条件下或血管狭窄期间的病理条件下所产生的应力，从而由脐带静脉内皮细胞制备细胞外囊泡。这些应力是由生产细胞进入微流体通道持续4小时而造成的。微流体芯片包括两百个通道，其中细胞以层流方式运输，以平行方式制备囊泡。

然而，该方法存在尺寸问题：由微流体芯片制备的囊泡的量与上述应用所需的量不相适应。此外，引入这种芯片的每个细胞制备的细胞外囊泡的产率(每个细胞约2×10⁴个囊泡)远低于细胞制备的囊泡的最大理论产率，例如，对于MSC型细胞(间充质干细胞的缩写)，每个细胞约3.5×10⁶个囊泡。最后，该方法需要符合称为G.M.P.(Good ManufacturingPractises的缩写)的标准，这是制造药物所必需的。

文献中常用的第二种方法由Piffoux等人描述，其包括在无血清的DMEM型培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基的缩写)中培养脐带静脉内皮细胞持续三天(称为饥饿或血清饥饿技术)。血清的缺乏导致细胞应力触发生产细胞释放囊泡。与使用微流体芯片的方法相比，该方法具有更高的产率并且允许制备更多的囊泡(每个生产细胞约4×10⁴个囊泡)。但是，计算出的产量对应的制备时间比前种方法的制备时间长得多。该方法不允许制备足够用于上述应用的细胞外囊泡。最后，该方法不允许连续制备囊泡，因为其会诱导细胞死亡。