[发明专利]从宿主细胞半乳糖凝集素和其他污染物中纯化糖基化蛋白的方法

权利要求书

1.一种从污染物中纯化经糖基化的重组目的蛋白的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(a)在中性pH下，将宿主细胞培养上清液或滤液上样到蛋白A基质上，所述宿主细胞培养上清液或滤液包含经糖基化的重组目的蛋白POI和半乳糖凝集素-3污染物，其中，POI包含免疫球蛋白Fc结构域的C_H2结构域和C_H3结构域和一个以上末端β-半乳糖残基，半乳糖凝集素-3污染物可逆地结合到所述末端β-半乳糖残基；

(b)用pH为6.0至6.5的包含1M至3M氯化钙的缓冲液，洗涤结合有POI的蛋白A基质；

(c)用pH低于4的包含柠檬酸或柠檬酸盐的缓冲液，将POI从蛋白A基质洗脱到洗脱合并液中，并且：

(i)如果洗脱合并液的碱性大于pH 3.3至3.7的pH范围，则用柠檬酸将洗脱合并液滴定至pH 3.3至3.7，以及

(ii)可选地，将洗脱合并液在pH 3.3至3.7保持足以灭活病毒的一段时间；

(d)在pH为5.0至5.5的2mS至15mS的低电导率缓冲液中，使来自(c)的洗脱合并液中的POI结合到CEX基质；

(e)用电导率递增的电解质浓度梯度，最高40mS至100mS，将POI从CEX基质洗脱到CEX洗脱合并液中；以及

(f)在pH 5.0至6.0的高电导率缓冲液中，将CEX洗脱合并液上样到疏水相互作用色谱HIC基质上，并洗涤HIC基质，

由此将POI与半乳糖凝集素-3污染物分离；用于HIC上样的高电导率缓冲液的电导率为40mS至100mS，用于HIC洗涤的高电导率缓冲液的电导率与用于HIC上样的高电导率缓冲液的电导率相同或更高。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在(b)中，用包含2M至2.7M氯化钙的缓冲液，洗涤结合有POI的蛋白A基质。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述POI选自：阿柏西普、阿法西普、依那西普、阿巴西普、贝拉西普、rFVIIIFc、rFIXFc和利纳西普。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述POI是阿柏西普。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述宿主细胞培养上清液或滤液还包含金属阳离子污染物，所述POI也与金属阳离子污染物分离。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述金属阳离子污染物选自：铝阳离子、钡阳离子、钙阳离子、钴阳离子、铜阳离子、锌阳离子、铁阳离子、镁阳离子、锰阳离子、汞阳离子、镍阳离子和锶阳离子。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述金属阳离子污染物是铁阳离子。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括：在使来自(c)的洗脱合并液中的POI结合至CEX基质之前，对洗脱合并液进行包括通过硅藻土过滤的深度过滤。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述硅藻土用柠檬酸盐缓冲液预处理。