[发明专利]无缝核酸装配方法在审
| 申请号： | 201880052429.1 | 申请日： | 2018-06-12 |
| 公开（公告）号： | CN111566209A | 公开（公告）日： | 2020-08-21 |
| 发明（设计）人： | 丽贝卡·纽金特;陈思远;埃利安·李;内森·雷纳德 | 申请（专利权）人： | 特韦斯特生物科学公司 |
| 主分类号： | C12N15/09 | 分类号： | C12N15/09;C12N15/10;B01J19/00 |
| 代理公司： | 北京安信方达知识产权代理有限公司 11262 | 代理人： | 武晶晶 |
| 地址： | 美国加利*** | 国省代码： | 暂无信息 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 无缝 核酸 装配 方法 | ||
1.一种核酸装配方法，其包括：
(a)提供多个多核苷酸，其中每个所述多核苷酸不包含与所述多个多核苷酸中的另一个多核苷酸具有序列同源性的末端区域；以及
(b)将所述多个多核苷酸与外切核酸酶、内切核酸酶、聚合酶和连接酶混合，其中基于相邻多核苷酸之间的互补序列，所述多个多核苷酸以持续的预定顺序退火。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述外切核酸酶是外切核酸酶III。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述内切核酸酶是瓣状内切核酸酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述瓣状内切核酸酶是瓣状内切核酸酶1、外切核酸酶1、XPG、Dna2或GEN1。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶具有5’至3’聚合酶活性。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接酶催化至少两个核酸的连接。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述瓣状内切核酸酶1的浓度在约0.32U至约4.8U的范围内。
9.根据权利要求2所述的方法，其中所述外切核酸酶III的浓度在约0.1U至约10U的范围内。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述聚合酶的浓度在约0.01U至约2U的范围内。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述连接酶的浓度至多约为2.0U。
12.根据权利要求7所述的方法，其中所述连接酶的浓度在约4.0U至约8.0U的范围内。
13.一种核酸装配方法，其包括：
(a)提供第一双链核酸；
(b)提供第二双链核酸；
(c)提供第三双链核酸，其以5'至3'的顺序包含：5'侧翼衔接子序列、与所述第一双链核酸同源的第一同源序列、与所述第二双链核酸同源的第二同源序列和3'侧翼衔接子序列，其中所述第一双链核酸、第二双链核酸和第三双链核酸在末端区域包含非同源序列；以及
(d)将所述第一双链核酸、第二双链核酸和第三双链核酸与包含外切核酸酶、内切核酸酶、聚合酶和连接酶的反应混合物混合。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述外切核酸酶是外切核酸酶III。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述内切核酸酶是瓣状内切核酸酶。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述瓣状内切核酸酶是瓣状内切核酸酶1、外切核酸酶1、XPG、Dna2或GEN1。
17.根据权利要求13所述的方法，其中所述聚合酶具有5’至3’聚合酶活性。
18.根据权利要求13所述的方法，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。
19.根据权利要求13所述的方法，其中所述连接酶催化至少两个核酸的连接。
20.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一双链核酸的同源序列或所述第二双链核酸的同源序列为约10个至约100个碱基对。
21.根据权利要求16所述的方法，其中所提供的瓣状内切核酸酶1的浓度为约0.32U至约4.8U。
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