[发明专利]具有改进的精度和特异性的碱基编辑器

说明书

用于改进靶向性碱基编辑技术的全基因组特异性的方法和组合物。

优先权声明

本申请要求2017年5月25日提交的美国临时专利申请系列号62/511,296；2017年8月4日提交的美国临时专利申请系列号62/541,544；和2018年1月26日提交的美国临时专利申请系列号62/622,676的权益。前述文献的完整内容通过引用的方式并入。

联邦赞助研究或开发

本发明借助美国政府支持在国立卫生研究院授予的授权号GM118158下做出。美国政府在本发明中享有某些权利。

技术领域

本文中描述用于改进靶向性碱基编辑技术的全基因组特异性的方法和组合物。

背景技术

碱基编辑(BE)技术使用一种工程化的DNA结合结构域(如RNA指导的、无催化活性Cas9(死Cas9或dCas9)、切口酶形式的Cas9(nCas9)、或锌指(ZF)阵列)以将胞苷脱氨酶结构域招募至基因组特定位置，以实现位点特异性胞嘧啶→胸腺嘧啶转换置换^1,2。BE是用于治疗细胞背景下表现出的遗传疾病的特别有吸引力工具，其中通过同源介导修复(HDR)产生精确突变将是治疗有益的，但是难以由基于核酸酶的传统基因组编辑技术产生。由于HDR途径限于细胞周期的G2和S期，例如，在主要由缓慢分裂或有丝分裂后的细胞群组成的组织中难以或不可能实现HDR结果³。此外，通过非同源末端接合介导对核酸酶诱导断口(break)的修复所致竞争性和更有效诱导可变长度插入/缺失突变，可导致HDR修复的效率在编辑前后大幅度降低。相反，BE技术具有允许实施者在无需细胞类型可变的DNA修复机制情况下产生高度可控、高度精确突变的潜力。

发明内容

CRISPR碱基编辑器平台(BE)拥有在无需供体DNA分子情况下产生精确的、用户限定的基因组编辑事件的独特能力。碱基编辑器(BE)按照位点特异性方式有效诱导胞苷至胸苷(C至T)碱基转换，如通过CRISPR指导RNA(gRNA)间隔子序列确定的，其中所述碱基编辑器包含与胞苷脱氨酶结构域和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)(例如，BE3)融合的产生单链切口的CRISPR-Cas9(nCas9)蛋白¹。与全部基因组编辑试剂一样，至关重要的是，在用于治疗药之前，首先确定然后降低BE产生脱靶突变的能力，从而限制其产生有害和不可逆基因编码副作用的潜力。这里，我们提出对BE技术的技术改进，所述改进将使其能够向临床意义成熟。首先，我们描述了通过建立利用天然或工程化脱氨酶的BE，限制可用于BE脱氨的可用胞嘧啶底物的绝对数目的方法，所述脱氨酶仅可以使特定2-或3-核苷酸基因组背景下存在的胞嘧啶脱氨(表1)。

这些蛋白质可以包含表7中列出的一个或多个突变，例如，单独或以任何可能组合用于增加脱氨酶蛋白或结构域的特异性。这些蛋白质可以包含表8中列出的一个或多个突变，例如，旨在改变可靶向的基序序列的突变，任选地与表7中的任何突变组合，例如，以产生底物序列改变和增加的工程化脱氨酶蛋白或结构域。另外，这些蛋白质可以包含表9中列出的一个或多个突变，任选地与表7或表8中列出的任何突变组合以产生工程化脱氨酶蛋白，例如，具有对三核苷酸基序中的第一或第三核苷酸改变的特异性并且具有相对于其他可能的脱氨底物基序，对其靶基序为增加的特异性。

在一些实施方案中，hAID、rAPOBEC1*、mAPOBEC3、hAPOBEC3A、hAPOBEC3B、hAPOBEC3C、hAPOBEC3F、hAPOBEC3G、或hAPOBEC3H的工程化变体包含表7、表8和/或表9中显示的一个或多个突变。在一些实施方案中，所述突变是N57A/G/Q/D/E；A71V；I96T；Y130F；或K60A/D/E或其组合。