[发明专利]用于蛋白酶的成像/检测的化学发光探针

说明书

本发明提供能够检测或成像、更具体地确定蛋白酶的存在或测量其水平的、基于Schaap的金刚烷叉基‑二氧杂环丁烷探针的turn‑ON型二氧杂环丁烷系化学发光探针，及其组合物和用途。

技术领域

本发明提供能够检测蛋白酶的二氧杂环丁烷系化学发光探针，及其组合物和用途。

缩写：ACN，乙腈；DCM，二氯甲烷；DIPEA，二异丙基乙胺；DMF，N,N'-二甲基甲酰胺；EEDQ，N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉；Et₂O，二乙醚；Et₃N，三乙胺；EtOAc，乙酸乙酯；HBTU，2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐；HPLC，高压液相色谱；K₂CO₃，碳酸钾；MeOH，甲醇；Na₂S₂O₃，硫代硫酸钠；Na₂SO₄，硫酸钠；NH₄Cl，氯化铵；PABA，对氨基苯甲酸；PEG，聚乙二醇；RLU，相对光单位；RP-HPLC，反相高压液相色谱；TFA，三氟乙酸；TIPS，三异丙基硅烷；TLC，薄层色谱；TMS-Cl，三甲基氯硅烷；7HC，7-羟基香豆素。

背景技术

蛋白酶是通过肽键的水解进行蛋白质分解代谢的一类酶。蛋白酶在许多生物学过程中具有基本作用，并且与多种病理状况，包括癌症、关节炎、神经变性和心血管疾病有关。在蛋白酶参与疾病的有力证据下，蛋白酶在成像和药物开发中起着重要作用。组织蛋白酶B(溶酶体半胱氨酸蛋白酶)是非常重要的，因为它在许多不同的癌症种类中在病理状况下在细胞外和细胞周基质中过表达，所述癌症包括例如，乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、头颈癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌。因此，已经付出很多努力来开发分子和医学成像技术，通常集中在蛋白酶活性上，特别是组织蛋白酶B活性上。大多数开发围绕光学成像，针对荧光成像。

尽管荧光成像允许灵敏的监测，但是它也具有缺点，主要是由于自发荧光导致低的信噪比。与基于荧光的分析不同，化学发光分析不需要光激发，导致增加的灵敏度和提高的信噪比。

在已知的化学发光探针中，Schaap的金刚烷叉基(adamantylidene)-二氧杂环丁烷探针(方案1，结构I)具有最高的适用性，因为它们带有稳定的二氧杂环丁烷部分，使其适合许多化学和生物学条件。如方案1所示，Schaap的金刚烷叉基-二氧杂环丁烷系化学发光探针(结构I)设置有用于掩蔽探针的酚部分的分析物响应性保护基团。通过目标分析物除去保护基团产生不稳定的酚盐-二氧杂环丁烷物质II，其通过化学激发过程而分解以产生受激发的中间体苯甲酸酯III和金刚烷酮。受激发的中间体通过蓝光光子的发射而衰变至其基态(苯甲酸酯IV)。

方案1：Schaap的金刚烷叉基-二氧杂环丁烷的化学发光激活途径

Richard等人(2007)之前开发了turn-ON型化学发光探针，其带有掩蔽二氧杂环丁烷发光体的苯酚的蛋白酶(青霉素g-酰胺酶或半胱天冬酶-3(caspase-3))响应性底物。尽管这些探针显示显著的信噪比，但由于需要两步分析，因此它们禁止蛋白酶的活细胞成像。首先，蛋白酶在生理pH(7.4)下使保护基团裂解，然后将混合物添加至pH为12.3的缓冲液，使化学激发过程得以发生。

国际公开号WO2017/130191公开了基于Schapp的金刚烷叉基-二氧杂环丁烷探针的化学发光探针，其中通过直接作用模式放大化学发光，更特别地，其中Schapp的金刚烷叉基-二氧杂环丁烷探针在酚环的邻位被如丙烯酸酯和丙烯腈吸电子基团等π*受体基团取代，以增加苯甲酸酯物质的发射性质(方案2)。如该公开中所示，所公开的化学发光探针使酶水解和化学激发过程在生理条件下同时发生，具有显著的化学发光强度。

方案2：通过使Schapp的金刚烷叉基-二氧杂环丁烷探针在酚环的邻位被π*受体基团取代而获得的直接化学发光模式