[发明专利]用于改进编索引的核酸文库中的样品鉴定的组合物和方法

说明书

本发明涉及组合物和方法，所述组合物和方法通过在扩增和测序之前，封闭从多个样品汇集的编索引(indexed)的多核苷酸的3’末端来提高用于多重化下一代测序的编索引的核酸文库制备物中的正确样品鉴定率。

相关申请

本申请要求于2017年4月23日提交的美国临时申请第62/488,824号的权益，该美国临时申请通过引用并入本文。

领域

本公开内容尤其涉及对来自多个编索引的(indexed)文库的多核苷酸的测序；并且更特别地，涉及增加测序正确地鉴定出多核苷酸所起源的文库的可能性。

背景

测序方法学的改进已经允许在单一测序方案中对来自不同文库的汇集的或多重化的多核酸(multiplexed polynucleic acid)测序。可以将文库特异性序列(“索引标签(index tag)”)添加到每个文库的多核酸，使得可以正确地鉴定出每个被测序的多核酸的起源。可以通过例如将包含索引标签序列的衔接子连接到多核酸的末端而将索引标签序列添加到文库的多核酸。

衔接子可以包含除索引标签序列之外的序列，诸如通用延伸引物序列和通用测序引物序列。通用延伸引物序列尤其可以与偶联到固体表面的第一寡核苷酸杂交。第一寡核苷酸可以具有游离3’末端，聚合酶可以使用杂交的文库多核苷酸作为模板从游离3’末端添加核苷酸，以使该序列延伸，导致文库多核苷酸的反向链被偶联到固体表面。正向链和反向链的另外的拷贝可以通过簇扩增偶联到固体表面。簇扩增的一个实例是桥式扩增，其中与固体表面结合的先前扩增的多核苷酸的3’末端与与固体表面结合的第二寡核苷酸杂交。第二寡核苷酸可以具有游离3’末端，聚合酶可以使用偶联的反向链多核苷酸作为模板从游离3’末端添加核苷酸，以使该序列延伸，导致文库多核苷酸的正向链经由第二寡核苷酸偶联到固体表面。可以重复该过程以产生偶联到固体表面的正向链和反向链的簇。在测序之前，可以例如通过裂解去除正向链或反向链。

测序引物可以与偶联到固体支持物的多核苷酸链的一部分杂交。例如，测序引物可以与通用测序引物序列(如果存在的话)杂交。测序可以通过使用偶联的多核苷酸作为模板多轮地将核苷酸添加到测序引物并且检测所添加的核苷酸的身份进行。测序引物的杂交可以发生在偶联的多核苷酸链上的一个位置处，以允许对索引标签序列以及偶联到固体表面的多核苷酸的靶序列进行序列鉴定，或可以使用单独的测序引物来对索引标签序列和靶序列单独地测序。因此，可以基于与靶序列缔合的索引标签序列，将靶序列索引到特定的文库来源。

尽管每个待测序的多核酸包含文库特异性索引标签序列，但由于被称为索引跳跃(index hopping)的现象，在鉴定被测序的多核酸的文库来源时可能发生错误。当来自一个文库的索引标签序列不经意地被添加到来自另一个文库的多核酸时，索引跳跃发生。索引跳跃可能发生在文库制备或在用于测序的流动池或其他合适的固体支持物上进行多核苷酸的簇扩增期间。索引跳跃可能使测序的结果混淆，诸如导致被测序的多核苷酸的文库来源的不当指定。

简述

本公开内容的一个或更多个方面通过在文库样品制备期间封闭多核酸包括未掺入的衔接子的3’末端，解决了与索引跳跃相关的至少一种潜在机制。不意图受理论束缚，认为当包含用于一个文库的索引标签序列的未掺入的衔接子与来自另一个文库的衔接子的一部分杂交并且未掺入的衔接子在簇扩增期间用作引物时，索引跳跃可能发生。因此，来自一个文库的靶序列可以用来自另一个文库的衔接子的索引标签加标签。在随后的多轮簇扩增期间，被错误加标签的靶的另外的拷贝可能在测序之前被扩增。这样的索引跳跃可能使随后测序的结果混淆。通过在文库样品制备期间封闭文库中的多核苷酸包括未掺入的衔接子的3’末端，未掺入的衔接子在簇扩增期间用作引物的能力将被阻断。

如本文使用的，多核苷酸或寡核苷酸的“封闭的”3’末端是多核苷酸或寡核苷酸的被修饰的3’末端，所述修饰防止核苷酸掺入在所述3’末端而延伸所述多核苷酸或寡核苷酸。例如，3’核苷酸可以包含3’双脱氧核苷酸。