[发明专利]扩增胆管细胞的方法

说明书

本发明涉及使用其中经典的Wnt信号传导被抑制并且非经典的Wnt/PCP信号传导被增强的培养条件扩增呈胆管细胞类器官(CO)的形式的原代胆管细胞。提供了扩增原代胆管细胞的方法、扩增的胆管细胞群体和扩增的胆管细胞的医学应用。

资助

产生本发明的工作已获得欧盟第七框架计划(FP7/2007-2013)ERC拨款协议编号281335的欧洲研究委员会的资助以及MRC-Sparks临床研究培训奖学金(MR/L016761/1)的资助。

领域

本发明涉及分离和增殖原代成年或小儿人胆管细胞，其用于例如疾病建模、药物筛选和再生医学。

背景

肝外胆道病症引起相当大的发病率和死亡率。实际上，70％的小儿肝移植是为了治疗胆管闭锁而进行的(Murray K.F.&Carithers R.L.,Hepatology 2005,41:1407–1432)。原发性硬化性胆管炎(PSC)仅占美国肝移植的5％(Perkins J.D.,LiverTransplant 2007,13,465-466)，并且胆系并发症是已故肝移植后移植失败的主要原因(Skaro A.I.等人,Surgery 2009,146:543-553；Enestvedt C.K.等人,LiverTranspl.2013,19:965-72)。然而，肝外胆管上皮细胞的研究受到原代胆管细胞的长期培养和大规模扩增的技术挑战的限制。迄今为止，这些挑战阻止了开展针对靶向PSC和其他胆管病的药物筛选和基于细胞的疗法的大规模实验。此外，由于缺乏可用于重建和替换患病胆管和/或胆囊的健康供体组织，治疗选择仍然受限(Gallo A.&Esquivel C.O,Pediatr.Transplant.2013,17:95–98；Felder S.I.等人,JAMA Surg 2013,148:253-7-8)。

天然胆管细胞的体外扩增可以应对这一挑战，并提供适用于组织工程应用(如胆道重建)的细胞。然而，原代胆管上皮细胞的培养仍然存在问题(Sampaziotis,F等人,Hepaology 2015,62:303-311)。先前已经报道了使用类器官培养系统衍生原代肝干细胞(Huch M等人；Cell 2014 160:299-312)。然而，所得细胞在体内分化为功能性胆管细胞并在胆树中填充的能力仍有待证明。此外，此类平台的体内应用受到在移植和/或分化为非胆管细胞类型后能够不适当增殖的污染的干细胞的限制。有限的进入人体组织构成了基于原代细胞的系统的相当大的障碍。

概述

本申请的发明人已经认识到经典的Wnt信号传导被抑制并且非经典的Wnt/PCP信号传导被增强的培养条件出乎意料地允许有效扩增呈胆管细胞类器官(CO)的原代胆管细胞。如本文所述的扩增的原代胆管细胞群体可用于例如可再生医学中。

本发明的一方面提供了在体外扩增原代胆管细胞的方法，其包括：

(i)提供分离的原代胆管细胞群体，和

(ii)在包含表皮生长因子(EGF)、经典的Wnt信号传导抑制剂和非经典的Wnt信号传导增效剂的扩增培养基中培养所述群体以产生扩增的群体。

胆管细胞可在扩增培养基中形成类器官。

非经典的Wnt信号传导增效剂可以为经典的和非经典的Wnt信号传导的增效剂，优选R-脊椎蛋白。

经典的Wnt信号传导抑制剂可以为Dickkopf相关蛋白1(DKK-1)。

优选地，将原代胆管细胞在扩增培养基中以三维培养进行培养。

在一些实施方案中，所述方法还可包括破坏类器官以产生分离的胆管细胞群体。分离的胆管细胞可在扩增培养基中进一步培养以扩增或增殖群体。