[发明专利]制备巨型单层囊泡形式的功能性合成细胞的方法

说明书

本发明涉及一种制备巨型单层囊泡形式的原始细胞的方法，该方法包括以下步骤：a)提供由外部聚合物壳包封的水基液滴，该外部聚合物壳与液滴的内部空间邻接，其中液滴的最大尺寸为0.5μm至1,000μm，其中液滴的内部空间含有至少一种脂质，b)将液滴的脂质内容物转化成脂质双层，该脂质双层布置在聚合物壳的内表面和油相处并覆盖聚合物壳的内表面和油相，以形成聚合物壳稳定化巨型单层囊泡，c)任选地将一种或多种蛋白质和/或核引入步骤b)中提供的聚合物壳稳定化巨型单层囊泡中，以及d)任选地从聚合物壳稳定化巨型单层囊泡中去除所述聚合物壳和油相并任选地将其从油转移到水相。

技术领域

本发明涉及制备巨型单层囊泡形式的合成细胞的方法以及用该方法可获得的合成细胞。在下文中，合成细胞仅被称为原始细胞。

背景技术

基于脂质膜的区室的形成是真核细胞与原核细胞的区别特征之一。区室提供物理和化学屏障，其防止分子组分不受控制地扩散到周围环境中和从周围环境中不受控制地扩散出来，从而允许独立自足的代谢、信号传导或合成活动。此外，生物膜允许通过各种跨膜蛋白(如离子通道和受体)的细胞内和细胞间化学选择性物质转运和信号转导。因此，机械和化学上良好限定和良好控制的区室是开发和加工寿命的必要要素。在合成生物学的背景下，原始细胞是合成的、含生物分子的、基于脂质的区室。这些区室可以是小单层囊泡(缩写为SUV)、大单层囊泡(缩写为LUV)或巨型单层囊泡(缩写为GUV)。小单层囊泡、大单层囊泡和巨型单层囊泡通常是球形的，小单层囊泡直径通常为25nm至50nm，大单层囊泡直径通常大于50nm至1,000nm，巨型单层囊泡直径通常为1μm至1,000μm。然而，不饱和脂肪酸在高离子强度条件下，尤其是多价阳离子条件下的化学和机械不稳定性，以及它们对pH变化的敏感性被认为是利用原始细胞进行合成生物的主要挑战。此外，考虑到它们的不渗透性和机械不稳定性，将分子插入原始细胞代表着特别的挑战。

电铸成形是一种依赖于干燥的脂质膜在水溶液中的水合过程中施加低电压，通常是交变电场的方法。更具体地，在该技术的一个已知的变体中，通过施加交流电，在夹在涂覆有氧化铟锡电极的玻璃载片之间的通道中形成巨型单层囊泡。然而，生理缓冲溶液中的低GUV产量、GUV的脂质组成的不均一性以及对少量带电脂质(＜10％)的强烈限制仍然是用于GUV生产的电铸成形法的主要缺点。与此不同，微流体相转移方法包括在回路中，通过低毛细管数下的聚焦流动而产生的脂质稳定的油包水液滴，在高毛细管数下呈现平行的囊泡外含水流体(aqueous flow)。这些液滴在到达微穿孔柱后经由脂质稳定的油/水界面物理转移，收集脂质的第二外包被以完成囊泡双层。微流体方法的优点是可以通过控制均匀的区室尺寸以高通量地生产GUV。此外，与电铸成形法相比，膜组合物和缓冲条件的选择更灵活。然而，可操作性仍然独立于生产方法而受到限制，因为如此获得的GUV主要由于不饱和脂肪酸和磷脂在高离子强度条件下的化学和机械不稳定性而在化学上、特别是机械上不稳定，使得它们不能例如通过皮可注射(pico-injection)技术而另外地或顺序地负载蛋白质，特别是跨膜蛋白和细胞骨架蛋白。

已知有由两亲性嵌段共聚物制成的聚合物囊泡作为巨型单层囊泡形式的原始细胞的替代区室。它们封装水溶液并且通常被水溶液包围。因为一些聚合物囊泡在化学和机械上都比巨型单层囊泡形式的原始细胞更稳定，并且是可根据某些环境和功能进行调节的，所以一些聚合物囊泡可以用跨膜蛋白或使某些化学物质能够通过聚合物膜的合成通道分子进行工程化。然而，与在化学和物理性质的操作上具有限制性的巨型单层囊泡不同，聚合物膜的厚度、弯曲和拉伸模量通过改变嵌段共聚物分子性质来调节。然而，生物分子的包封和传统水包水聚合物囊泡的进一步操作仍然是挑战。聚合物囊泡的渗透性不受控制和缺乏允许精确和有效递送不同生物组分的技术是主要缺点。