[发明专利]C1-酯酶抑制剂制剂

说明书

本发明涉及稳定的C1‑酯酶抑制剂(C1‑Inh)制剂，其是液体或冻干的，其特征在于组氨酸含量为5‑400mM，但不含柠檬酸盐或磷酸盐。它还涉及包含C1‑Inh制剂的试剂盒。

发明技术领域

本发明涉及高纯度C1-Inh制剂配方以及从含C1-Inh的原料获得高纯度C1-酯酶抑制剂(C1-Inh或C1I)的纯化方法。

发明背景

C1-酯酶抑制剂是一种单链糖蛋白，具有478个氨基酸残基，通过SDS电泳测得的单分子表观分子量约为106kDa。它主要在肝脏中产生，并以大约0.14-0.38mg/ml的浓度存在于正常的人血浆中，相当于1单位/ml血浆[Production of Plasma Proteins forTherapeutic Use,First Edition,241-258，由Joseph Bertolini、Neil Goss和JohnCurling编辑，2013John Wiley&Sons]。

已知C1-Inh的定性或定量缺陷是遗传性或先天性血管性水肿(HAE)的根本原因，这是一种遗传性罕见疾病，表现为真皮、皮下组织、粘膜和粘膜下组织的肿胀。血管性水肿是一种潜在的威胁生命的疾病，因为可能会发生气管或导管阻塞，最终可能会导致窒息。

一种可能的治疗途径是在急性发作期间或作为终生预防性治疗采用功能性C1-酯酶抑制剂替代功能障碍或缺失的蛋白质。在这两种情况下，都建议使用尽可能高纯度的C1-Inh浓缩物，以免产生不良作用，例如出现抗C1-Inh的抗体。因此，所选产品应实际上不含任何其他蛋白质以及C1-Inh聚集体或者降解的或功能异常的C1-Inh，以特别促进终生预防性治疗，而不会产生抗体或发展出其他不良事件。在急性发作气管阻塞的情况下，医学上建议尽早使用C1-Inh制剂以避免可能的窒息。

可以通过静脉内或皮下注射血浆或重组来源的C1-Inh制剂的替代疗法来治疗上述缺陷症。然而，该种治疗的问题在于存在将病原体(例如病毒)引入患者体内并因此引起其他疾病的风险。因此，建议仅使用C1-Inh组合物来恢复生理水平的C1-Inh，其在制造过程中包括减活和灭活步骤使组合物经历病原体减活步骤。

尽管已知了高纯度和低聚集体含量的C1-Inh浓缩物，但是这些制剂以液体形式时尤其不稳定。因此，已知稳定的C1-Inh制剂仅有冻干产品，其缺点是在用于治疗影响气管的急性发作而重建的过程中浪费了宝贵的时间，从而会在急性HAE发作期间危及患者的生命。

在过去的几十年中，已经报道了各种纯化C1-Inh的方法，其中大多数方法至少包含一个沉淀步骤和若干色谱分析步骤。

Sim和Reboul描述过一种方法。对血浆进行聚乙二醇(PEG)沉淀，然后使用DEAE树脂进行阴离子交换色谱分析(AEX)并使用伴刀豆球蛋白A树脂进行色谱分析。所获得的产物在SDS-page凝胶上显示出超过95％的纯度，含有至少2种60kDa和30kDa的杂质。

Prograis等描述了一种C1-Inh的纯化方法，其首先是人血浆的PEG分馏，接着在DEAE树脂上进行AEX色谱分析和金属螯合物色谱分析。最后，该方法包括免疫吸附色谱分析。将C1-Inh保存在磷酸盐缓冲的氯化钠(PBS)中，在非还原条件下，其在SDS-PAGE上显示含有少量约93kDa的杂质。

Teh和Froger公开了纯化C1-Inh的方法，采用DEAE树脂分批吸附冷冻上清液，随后在CM树脂上进行PEG沉淀和阳离子交换色谱分析。冻干和热处理的产物在SDS-PAGE凝胶上显示出超过95％的纯度，仅有一个可见带。

US-4,915,945涉及一种纯化C1灭活剂的方法，该方法包括用DEAE树脂分批吸附冷冻上清液，然后用QAE树脂分批吸附DEAE吸附步骤中的上清液。从QAE树脂洗脱C1-Inh并通过硫酸铵沉淀，将重新溶解的沉淀物在上进行疏水相互作用色谱分析(HIC)。