[发明专利]多转入基因重组腺病毒

说明书

本发明涉及包含被可切割连接物隔开的两个或更多个治疗性转入基因例如异二聚体细胞因子的两种组分的重组病毒。

与相关申请的交叉引用

本申请要求2017年4月12日提交的美国临时专利申请系列号62/484,841的利益和优先权，所述临时申请在此整体通过引用并入本文。

技术领域

本发明的领域是分子生物学和病毒学，具体来说是表达两个或更多个治疗性转入基因的重组病毒。

背景技术

尽管对引起癌症的基础分子机制已有广泛了解，但大多数晚期癌症仍然不能使用当前的化疗和放疗方案治愈。溶瘤病毒作为有潜力显著增强当前用于各种不同恶性肿瘤的标准治疗的平台技术而出现(Kumar，S.等，(2008)CURRENT OPINION IN MOLECULARTHERAPEUTICS 10(4)：371-379；Kim，D.(2001)EXPERT OPINION ON BIOLOGICAL THERAPY 1(3)：525-538；Kim D.(2000)ONCOGENE 19(56)：6660-6669)。这些病毒已显示出作为溶瘤剂的希望，其不仅通过感染-繁殖-裂解的链式反应直接破坏恶性细胞，而且间接地诱导抗肿瘤免疫。这些免疫刺激性质通过每当病毒复制时复制并表达的治疗性转入基因的插入而被增强。

以前开发的溶瘤病毒包括被称为TAV-255的溶瘤5血清型腺病毒(Ad5)，其在正常细胞中转录弱化，但在癌细胞中活跃转录(参见PCT公开号WO2010101921)。据信，所述TAV-255载体实现这种肿瘤选择性的机制是通过转录因子Pea3和E2F的三个转录因子(TF)结合位点的定向缺失，这些转录因子是通过结合到特定DNA序列来调控病毒进入宿主细胞后最早转录的基因E1a的腺病毒表达的蛋白质。

尽管迄今为止已做出种种努力，但对用于在人类患者中治疗癌症和过度增殖性障碍的改进的重组病毒例如重组溶瘤病毒，仍存在着需求。

发明内容

本发明部分是基于下述发现，即对于表达两个治疗性转入基因的某些重组腺病毒例如重组溶瘤腺病毒来说，当所述两个治疗性转入基因被表达为具有居间的可切割位点例如可蛋白水解切割位点的单一多肽链时，每个治疗性转入基因的表达可以被大大提高。所述可切割位点随后可以用一种或多种切割试剂例如内源或外源切割试剂进行翻译后切割，以产生由每个治疗性转入基因编码的成熟蛋白产物。这种方法具有确保每个治疗性转入基因的化学计量表达和同时递送的额外优点。

一方面，本发明提供了一种重组腺病毒，其包含编码第一治疗性转入基因的第一核苷酸序列、编码第二治疗性转入基因的第二核苷酸序列和配置在所述第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间编码可切割位点的第三核苷酸序列。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含以5’至3’方向包含所述第一核苷酸序列、第三核苷酸序列和第二核苷酸序列的重组多核苷酸序列。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含以5’至3’方向连续包含所述第一核苷酸序列、第三核苷酸序列和第二核苷酸序列的重组多核苷酸序列，例如不存在配置在所述第一核苷酸序列与第三核苷酸序列之间和/或所述第三核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的居间核苷酸序列(例如含有另一个转入基因的序列或调控序列)。在某些实施方式中，所述第一核苷酸序列、第三核苷酸序列和第二核苷酸序列被可操作地连接到单一启动子(任选地位于所述第一核苷酸序列的第一核苷酸的5’)并被表达为单一多肽链。

所述可切割位点可以是可蛋白水解切割位点，例如被存在于真核细胞的内质网或高尔基体中的蛋白酶切割的可蛋白水解切割位点。在某些实施方式中，所述可蛋白水解切割位点是弗林蛋白酶可切割位点，例如包含序列RX₁X₂R(SEQ ID NO：6)的弗林蛋白酶可切割位点，其中X₁是任何氨基酸，并且X₂是Lys或Arg，例如包含序列RAKR(SEQ ID NO：7)的弗林蛋白酶可切割位点。

在某些实施方式中，所述重组腺病毒是5型腺病毒(Ad5)或2型腺病毒(Ad2)。