[发明专利]用于纯化源自人胚胎干细胞的内胚层和胰腺内胚层细胞的方法

说明书

本发明涉及从源自多能干细胞、诱导多能干细胞和胚胎干细胞的细胞群中富集胰腺祖细胞的方法。本文公开了用于富集胰腺祖细胞的标志物CD51和CD177，以及用于富集或耗竭肝脏祖细胞的标志物CD275。

背景技术

由自身免疫反应引起的胰岛中β-细胞破坏是I型糖尿病的病因，但在II型糖尿病中，尽管是由其它机制介导的，但是该种疾病的晚期也可能发生β-细胞破坏。然而，患有这些疾病(尤其是I型糖尿病)的患者需要外源性胰岛素输送，但是选择正确的胰岛素剂量仍然是一个挑战，并可能导致血糖控制不佳。

胰岛的再生能力是非常有限的，因此胰岛细胞的移植可以改善葡萄糖耐量和控制。然而，胰岛细胞移植具有不同的局限性，这种局限性包括对供体器官的依赖、自胰腺中分离胰岛的挑战及终身使用免疫抑制药物。多能干细胞为供体胰岛细胞的不足提供了一种可能的解决方案。

现有技术中已经描述了若干用于将多能干细胞或胚胎干细胞分化为胰腺祖细胞或β-细胞的方法。例如Rezania等2014、Pagliuca等2014、D’Amour等2006或Kroon等2008。尽管所有这些方法都得到了相当比例的β-细胞，但通过这些方法产生的β-细胞是不成熟的，并且还可能包含一些未分化的多能干细胞，这些未分化的多能干细胞可能带来畸胎瘤形成的风险。

因此，在分化过程中富集细胞亚群，从而得到更大比例的胰腺祖细胞是非常重要的。在胰腺和胰岛发育过程中，细胞会经历各种中间体。一个重要的中间体是前定形内胚层(anterior definitive endoderm,ADE)的阶段。在本文中可以区分发育为胰腺谱系或其他谱系(如肝脏)的已特化亚群。专利申请US 2009/0263896A1和WO2016/170069A1公开了若干用于富集胰腺内胚层细胞的标志物。然而，这些专利申请在向胰腺β-细胞分化的后期阶段才对亚群进行分选。这些细胞使细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂上调，并失去了扩增大量细胞以用于细胞替代疗法的潜力。在ADE阶段即细胞仍然高度增殖时对胰腺祖细胞进行分选将克服上述扩增难题并允许自多能干细胞的大量胰腺祖细胞的可扩展生产。

然而，仍然需要分化早期的具有胰腺命运(fate)的定形内胚层亚群的可靠且优选地是改善的标志物，由此理想地改善自异质细胞群中选择特化的胰腺祖细胞，所述胰腺祖细胞有利地在随后的制备过程中仍然具有增殖的能力。因此，本申请所基于的技术问题是满足上述需求。本发明的发明人惊讶地发现，可以将细胞表面标志物CD51和/或CD177用于在定形内胚层阶段富集未来的胰腺祖细胞，而可以将细胞表面标志物CD275用于富集未来的肝谱系细胞或用于耗竭此类细胞。肝谱系细胞的耗竭可以用于移除不发育为胰腺祖细胞的细胞，由此富集能够发育为胰腺祖细胞的细胞。此外，可以将畸胎瘤形成细胞分出并且CD177和CD275可作为评估不同细胞系和不同方案中分化过程的工具。CD177亚群还显示出增加的WNT/平面细胞极性(PCP)信号传导。CD177+细胞显示出β-连环蛋白向膜的易位，因此促进了胰腺命运而非肝脏命运(实施例2和4，图2C-E，图4D)。CD177+细胞有效地生成了背侧胰腺(dorsal pancreas)(实施例3和7，图3C、D)，产生更紧密的簇并且具有组织极性(实施例5，图5E)。这些细胞显示出胰腺转录因子如PDX1或NKX6.1的更高表达(实施例5和9，图5C)并产生单激素细胞(实施例5和9，图5B)。此外，如实施例2、6和7所示，与现有技术中已知的CXCR4阳性细胞(CD184)相比，CD177阳性细胞产生的细胞群具有成为胰腺祖细胞的更高可能性。

发明概述

本文描述的实施方案涉及用于纯化源自多能干细胞、诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的胰腺祖细胞的方法，和包含所述纯化的胰腺祖细胞的组合物以及包含针对CD177的配体和用于将胰腺祖细胞分化为定形内胚层细胞群的手段的试剂盒。

因此，本发明涉及一种纯化胰腺祖细胞的方法，包括：