[发明专利]细胞培养方法

说明书

本发明涉及有限量的半胱氨酸和色氨酸在重组蛋白特别是抗体的生产过程中在细胞培养基中的用途。在此类受控条件下产生的蛋白质和抗体表现出降低的异质性，特别是降低的电荷变体异质性。

发明领域

本发明属于重组蛋白、特别是抗体的制备领域。更具体地，其涉及在商业规模的制造过程中以降低的异质性表达蛋白质的细胞培养方法。

发明背景

开发重组蛋白作为治疗性蛋白(诸如治疗性抗体)需要以工业规模生产重组蛋白。为了实现这一点，可以使用不同的表达系统，原核和真核系统。然而，在过去的二十年中，大多数被批准用作治疗剂的治疗性蛋白质已经通过哺乳动物细胞培养物生产，并且这种系统仍然是用于生产大量供人使用的重组多肽的优选表达系统。

然而，哺乳动物细胞培养呈现重大挑战。与其他真核生产系统(例如基于酵母和昆虫细胞的系统)相比，产生的重组蛋白的滴度通常非常低。

在过去的30年中，人们一直致力于建立细胞培养和重组多肽表达的基本参数，而研究的重点在于通过改变细胞培养基的组成(参见例如Hecklau C等，J Biotech 218(2016)53-63；Zang Li.等Anal.Chem 83(2011)5422-5430)和操作条件来达到最佳细胞生长以及大型生物反应器的开发。

尽管产量仍然是哺乳动物细胞培养的非常重要的方面，但近年来，重点已转向在开发的所有阶段和生产规模上控制产品质量和过程一致性。哺乳动物细胞培养物产生的治疗性蛋白表现出不同水平的异质性。这样的异质性包括但不限于不同的糖基化模式、由脱酰胺或氧化产生的差异、不同的电荷或大小变异。重组蛋白的异质性也可能导致产品颜色的差异，例如由相同制造工艺产生的同一蛋白质的不同批次之间的颜色差异。当以高浓度配制治疗性蛋白时，这种异质性，尤其是目标重组蛋白的颜色差异变得更加明显。近年来，一直存在向着要求以高浓度配制治疗性蛋白的皮下递送治疗性蛋白的稳定趋势。高浓度与聚集体水平升高相关(Purdie J.等，Biotechnology Progress,2016,32,998-1008)。电荷变体增加，诸如酸性种类水平升高可影响蛋白质的稳定性(Banks D.D.等Journal ofpharmaceutical sciences,2009,98,4501-10)，而浓缩的治疗性蛋白的颜色可以更强烈。

细胞培养条件，诸如培养基的组成(Kshirsagar R.等，Biotechnology andBioengineering,109:10,2523-2532(2012)；US 2013/0281355；WO 2013/158275)和生长条件，包括pH和温度(US 8,765,413)已显示出会影响治疗性蛋白的质量属性。然而，仍然需要提供用于生产治疗性蛋白、特别是具有最小异质性的治疗性抗体的进一步改进的细胞培养方法。

发明概述

本发明通过在重组蛋白的生产阶段中减少细胞培养基中半胱氨酸或胱氨酸和色氨酸的总量来满足上述需求。

如下文中所编号的，描述了下面的特定实施例：

实施方案1：一种产生重组蛋白的方法，其包括：

a.在培养基中培养能够产生重组蛋白的宿主细胞；

b.使培养进行通过生产阶段，其中重组蛋白由细胞产生，其中在所述生产阶段中，向培养物中补充

·半胱氨酸或胱氨酸，其总量达到产生的重组蛋白的预期总量的10wt％至30wt％；和/或

·色氨酸，其总量达到产生的重组蛋白的预期总量的8wt％至35wt％，

c.以及任选地，从细胞培养基中回收重组蛋白。