[发明专利]制备和使用胚胎间充质祖细胞的方法

说明书

本公开提供了生成非聚簇的干细胞的方法。中胚层分化之前的聚簇破坏提高了hEMP和T细胞分化的产量和效率。因此，该方法允许开发改进的hEMP和T细胞分化的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年5月26日提交的美国临时申请号62/511,907和2017年6月2日提交的美国临时申请号62/514,467的优先权，其两者以其整体通过引用并入本文。

发明背景

人类癌症就其本质而言包含已经经历了遗传或表观遗传转化而变成异常癌细胞的正常细胞。此时，癌细胞开始表达与正常细胞表达的蛋白质和其他抗原不同的蛋白质和其他抗原。这些异常的肿瘤抗原可以被身体的免疫系统用于特异性靶向和杀伤癌细胞。然而，癌细胞采用各种机制来防止免疫细胞如T和B淋巴细胞成功靶向癌细胞。

目前的T细胞疗法依赖于经富集或经修饰的人T细胞来靶向并杀伤患者中的癌细胞。患者或正常供体衍生的T细胞由于其缺乏自我更新在本质上是有限的。从干细胞来源衍生T细胞将为治疗用途提供潜在的细胞的无限来源。需要有效的体外方法以将多能干细胞分化为胚胎中胚层祖细胞和成熟T细胞。

发明概述

本发明尤其通过提供用于生成人胚胎间充质祖(hEMP)细胞的改进的方法、其衍生物及其在有效生成T细胞中的用途来满足该需求。

在一方面，本公开提供了生成人胚胎间充质祖(hEMP)细胞的方法，该方法包括以下步骤：使非聚簇的干细胞以确定的单细胞密度与基质接触；在促进细胞生长至期望的汇合的培养条件下培养干细胞；和改变培养条件以诱导干细胞在期望的温育时间内分化为hEMP细胞；从而生成hEMP细胞。

在一些实施方案中，非聚簇的干细胞是人胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞。在一些实施方案中，ES或iPS细胞是人来源的。

在一些实施方案中，ES或iPS细胞是H1细胞、H9细胞、HES3细胞、HSF1细胞、HSF6细胞、ESI-017细胞、CS02iCTR-NTn1细胞、CS03iCTR-NTn1细胞、CS80iCTR-Tn3细胞、CS179iCTR-NTn1细胞、CS201iCTR-NTn4细胞、CS202iCTR-NTn2细胞或CS206iCTR-Tn5细胞。

在一些实施方案中，确定的单细胞密度在约1.5x10⁵和约8x10⁵个细胞/cm²之间。在某些实施方案中，确定的单细胞密度为约1.89x10⁵个细胞/cm²、约3.2x10⁵个细胞/cm²、约3.4x10⁵个细胞/cm²、约3.6x10⁵个细胞/cm²、约3.79x10⁵个细胞/cm²、约7.2x10⁵个细胞/cm²或约7.58x10⁵个细胞/cm²。

在一些实施方案中，基质用或重组人玻连蛋白而不是小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)包被。在一些实施方案中，基质是孔板、细胞培养皿、膜、袋、培养瓶、反蛋白石、聚合物晶格、静态细胞悬液、搅拌细胞悬液或经等离子体处理的聚合物。在一些实施方案中，基质包含膜。

在一些实施方案中，促进细胞生长的培养条件包括在mTeSR1培养基中培养干细胞。在一些实施方案中，mTeSR1培养基进一步包含ROCK抑制剂。在某些实施方案中，mTeSR1培养基进一步包含ROCK抑制剂Y27632。

在一些实施方案中，细胞生长至在约20％和约80％之间的期望的汇合。在一些实施方案中，汇合为约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％或约80％。