[发明专利]制备和使用胚胎间充质祖细胞的方法

权利要求书

1.生成人胚胎间充质祖(hEMP)细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使非聚簇的干细胞以确定的单细胞密度与基质接触；

(b)在促进细胞生长至期望的汇合的培养条件下培养所述干细胞；和

(c)改变所述培养条件以诱导所述干细胞在期望的温育时间内分化为hEMP细胞；

从而生成hEMP细胞。

2.权利要求1的方法，其中所述干细胞是人胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞。

3.权利要求2的方法，其中所述ES或iPS细胞是人来源的。

4.权利要求3的方法，其中所述ES或iPS细胞是H1细胞、H9细胞、HES3细胞、HSF1细胞、HSF6细胞、ESI-017细胞、CS02iCTR-NTn1细胞、CS03iCTR-NTn1细胞、CS80iCTR-Tn3细胞、CS179iCTR-NTn1细胞、CS201iCTR-NTn4细胞、CS202iCTR-NTn2细胞或CS206iCTR-Tn5细胞。

5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述确定的单细胞密度在约1.5x10⁵和约8x10⁵个细胞/cm²之间。

6.权利要求5的方法，其中所述确定的单细胞密度为约1.89x10⁵个细胞/cm²、约3.2x10⁵个细胞/cm²、约3.4x10⁵个细胞/cm²、约3.6x10⁵个细胞/cm²、约3.79x10⁵个细胞/cm²、约7.2x10⁵个细胞/cm²或约7.58x10⁵个细胞/cm²。

7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述基质用或重组人玻连蛋白而不是小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)包被。

8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述基质是孔板、细胞培养皿、膜、袋、培养瓶、反蛋白石、聚合物晶格、静态细胞悬液、搅拌细胞悬液或经等离子体处理的聚合物。

9.权利要求8的方法，其中所述基质包含膜。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述促进细胞生长的培养条件包括在mTeSR1培养基中培养所述干细胞。

11.权利要求10的方法，其中所述mTeSR1培养基包含ROCK抑制剂Y27632。

12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述期望的汇合在约20％和约80％之间。

13.权利要求12的方法，其中所述汇合为约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％或约80％。

14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述改变培养条件的步骤包括添加X-VIVO^TM15。

15.前述权利要求中任一项的方法，其中所述温育时间在约2和约4天之间。

16.权利要求15的方法，其中所述温育时间为约2.0、约2.5、约3.0、约3.5或约4.0天。

17.权利要求16的方法，其中所述温育时间为约3.5天。