[发明专利]多重核酸扩增测定

说明书

本公开内容是单管多重测定，其能够使用多种用相同的荧光报道分子标记进行标记但各自具有不同的退火温度的杂交引物和探针同时检测多种核酸靶。可以使用多组杂交引物和探针进一步将所述测定多重化，各组用独立的荧光报道分子标记进行标记。

公开内容的领域

本公开内容大体上涉及核酸的体外扩增和检测。具体地，本公开内容涉及单管多重测定，其能够使用多组杂交引物和探针同时扩增和检测多种核酸靶，其中所述探针用相同的报道分子标记进行标记。可以使用几种报道分子进一步将所述测定多重化。

公开内容的背景

聚合酶链反应（PCR）已成为生物医学研究、疾病监控和诊断的普遍存在的工具。通过PCR扩增核酸序列描述于美国专利Nos. 4,683,195、4,683,202和4,965,188中。现在，PCR在本领域中是众所周知的，并且已经在科学文献中进行了广泛的描述。参见PCRApplications，（（1999）Innis等人，eds., Academic Press, San Diego），PCRStrategies，（（1995）Innis等人，eds., Academic Press, San Diego）；PCR Protocols，（（1990）Innis人，eds., Academic Press, San Diego），和PCR Technology，（（1989）Erlich，ed., Stockton Press, New York）。“实时”PCR测定能够同时扩增和检测和定量靶序列的起始量。Holland等人（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. 88:7276-7280和美国专利No. 5,210,015中描述了使用DNA聚合酶的核酸酶活性的基本TaqMan实时PCR测定。在2008年12月9日提交的美国申请序列No. 12/330,694中已描述了没有核酸酶活性的实时PCR（无核酸酶测定）。在美国专利No. 5,538,848中描述了在实时PCR中荧光探针的使用。

典型的实时PCR规程涉及对每种靶序列具有特异性的标记的探针的使用。探针优选用一种或多种荧光部分标记，所述荧光部分发射可检测波长的光。与靶序列或其扩增子杂交时，探针显示出可检测的荧光发射变化。

然而，实时测定的主要挑战仍然是在单个管中分析众多靶的能力。在实际上医学和诊断学的每个领域中，感兴趣的基因座的数目迅速增加。例如，仅举几个例子，必须在法医DNA分布、病原微生物检测、多基因座遗传病筛选和多基因表达研究中分析多个基因座。在当前方法的情况中，使测定多重化的能力受到检测仪器的限制。具体而言，在相同反应中多种探针的使用需要使用不同的荧光标记。为了同时检测多种探针，仪器必须能够区分由每种探针发射的光信号。当前的技术不允许在相同反应容器中检测多于四种的独立波长。例如，Bell等人（“Real-time quantitative PCR in parasitology,” Trends inParasitol. (2002) 18(8):337-342）最近调查了可用的实时定量PCR热循环仪，并报告没有一种具有多于四个的光学检测通道。因此，每种靶使用一种唯一标记的探针，在相同容器中可检测不多于四种独立的靶。实际上，至少一种靶通常是对照核酸。因此，实际上，在相同管中可检测不多于三种实验靶。因为光学硬件最多可能提供小的增量改进，所以除非在扩增和检测策略上进行了根本性改变，否则使测定多重化的能力将不能跟上临床需要。

公开内容概述