[发明专利]多重核酸扩增测定

权利要求书

1.一种用于检测单个样品容器中的多种靶核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

（a）使怀疑含有多种靶核酸的样品与（i）包括第一标记的探针和第一引物的第一引物/探针组和（ii）包括第二标记的探针和第二引物的第二引物/探针组接触，其中所述第一引物于第一温度与所述多种靶核酸中的靶核酸退火且所述第二引物于第二温度与所述多种所述靶核酸中的另外的核酸退火，并且所述第一温度高于所述第二温度；

（b）在扩增反应中扩增所述样品中的所述多种靶核酸，所述扩增反应包括至少两步退火/延伸温度分布，其包括第一步骤和第二步骤，所述第一步骤包括所述第一温度，且所述第二步骤包括所述第二温度；

（c）分别在至少一部分所述退火/延伸温度分布上顺序检测来自所述第一和第二标记的可检测信号；和

（d）测量所述多种靶核酸中每种靶核酸的相对量。

2.权利要求1的方法，其中所述第一和第二标记的探针各自用相同的报道分子部分标记。

3.权利要求2的方法，其中所述报道分子部分是荧光的。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述第一和第二标记的探针各自用报道分子部分和猝灭剂部分标记。

5.权利要求4的方法，其中所述报道分子部分和所述猝灭剂部分是荧光团。

6.权利要求4-5中任一项的方法，其中所述报道分子部分是荧光团，且所述猝灭剂部分是暗猝灭剂。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述检测步骤进一步包括（i）在所述第一步骤期间检测与由所述第一标记发射的信号相对应的第一信号，（ii）在所述第二步骤期间检测第二信号，以及（iii）从所述第二信号中减去所述第一信号以鉴定由所述第二标记发射的可检测信号。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述第一和第二步骤分别保持至少10秒。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述扩增反应在有DNA聚合酶混合物的情况下进行。

10.用于检测单个样品容器中的多种靶核酸的试剂盒，所述试剂盒在分开的容器、小瓶或区室中包括（i）包括第一标记的探针和第一引物的第一引物/探针组，以及（ii）包括第二标记的探针和第二引物的第二引物/探针组，其中所述第一引物于第一温度与所述多种靶核酸中的靶核酸退火且所述第二引物于第二温度与所述多种所述靶核酸中的另外的核酸退火，并且所述第一温度高于所述第二温度。

11.权利要求10的试剂盒，其进一步包括用于扩增靶核酸所必需的试剂。

12.权利要求10-11中任一项的试剂盒，其中所述第一和第二标记的探针各自用相同的报道分子部分标记。

13.权利要求12的试剂盒，其中所述报道分子部分是荧光的。

14.权利要求10-13中任一项的试剂盒，其中所述第一和第二标记的探针各自用报道分子部分和猝灭剂部分标记。

15.权利要求14的试剂盒，其中所述报道分子部分和所述猝灭剂部分是荧光团。

16.权利要求14-15中任一项的试剂盒，其中所述报道分子部分是荧光团，且所述猝灭剂部分是暗猝灭剂。

17.权利要求10-16中任一项的试剂盒，其进一步包括已知浓度的对照核酸。