[发明专利]在S2或S2’口袋中具有突变的枯草杆菌蛋白酶变体

说明书

本发明涉及一种枯草杆菌蛋白酶BPN’变体或其同源物，该枯草杆菌蛋白酶BPN’变体或其同源物与由序列编号:2或其同源序列表示的枯草杆菌蛋白酶BPN’相比包含以下突变：‑对应于位置75‑83的氨基酸的缺失；‑在对应于S221的氨基酸位置处的突变，该突变对应于S221C或S221硒代半胱氨酸，优选S221C；‑选自下组的至少一种另外的突变，该组由对应于以下的氨基酸位置组成：F189W、F189Y、S33D、S33T、N218D、N218T、N218E、N62D、N62S、N62W和N62Y；优选在对应于P225的氨基酸位置处的突变；其中这些氨基酸位置是根据由序列编号:2表示的枯草杆菌蛋白酶BPN'的序列定义的。本发明还涉及酶促合成肽。

本发明涉及一种酶，该酶是枯草杆菌蛋白酶BPN’变体或其同源物。本发明还涉及一种酶促合成肽的方法，其中使用了所述酶。

肽具有许多应用，例如作为药物、食品或饲料成分、或化妆品成分。

合成肽的方法是本领域通常已知的。寡肽可以通过高度优化的方法在溶液中或在固相上以逐步方式化学合成。然而，由于副反应，长于10-15个氨基酸的肽通常非常难以合成，并且因此纯化是麻烦的。因此，长于10个氨基酸的肽通常是通过以下方式合成的：侧链保护的寡肽片段的固相合成的组合，这些寡肽片段随后在溶液中经历化学缩合，例如如以10+10缩合以生成20个氨基酸的肽。化学侧链保护的寡肽片段缩合的主要缺点是，在激活该酰基供体的C末端氨基酸残基后，会发生外消旋作用。相反，酶催化的肽偶联完全没有外消旋作用，并且与化学肽合成相比具有若干其他优点，例如在侧链官能团上不存在副反应。对于工业应用而言，基于动力学方法(即，使用酰基供体C末端酯)的酶促肽合成概念最为有吸引力(参见例如N.Sewald和H-D.Jakubke,“Peptides:Chemistry and Biology[肽：化学和生物学]”,第一次重印版Wiley-VCH Verlag GmbH,Weinheim[魏因海姆]2002)。

化学酶促肽合成可能需要寡肽片段的酶促偶联，所述寡肽片段已经各自使用化学合成、发酵或通过化学和酶促偶联步骤的组合合成。已经公开了关于寡肽片段在水溶液中的酶促缩合的一些报道(Kumaran等人Protein Science[蛋白质科学],2000,9,734；等人Bioorg.Med.Chem[生物有机与药物化学快报].1998,6,891；Homandberg等人Biochemistry[生物化学],1981,21,3387；Komoriya等人Int.J.Pep.Prot.Res.[国际肽与蛋白质研究杂志]1980,16,433)。

Wells等人发现(US 5,403,737)，通过改变枯草杆菌蛋白酶BPN'(来自解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(序列编号(SEQUENCE ID NO):2))的活性位点，可以显著改善水溶液中寡肽的缩合。当引入两个突变，即S221C和P225A时，获得了一种枯草杆菌蛋白酶BPN’变体，称为subtiligase，与野生型枯草杆菌蛋白酶BPN’相比，其合成/水解比率(S/H比率)增加了500倍。在进一步的实验中，Wells等人向subtiligase添加了另外五个突变，即M50F、N76D、N109S、K213R和N218S，以使该酶更稳定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],1994,91,12544)。名为stabiligase的新突变体显现对十二碳硫酸钠(sodiumdodecasulphate)和盐酸胍具有适度更多的抵抗力，但水解仍是主要的副反应。例如，使用stabiligase将肽羧酰胺甲基酯(Cam酯)连接至肽胺，产率为44％。在此实例中，使用了10当量的肽C末端酯，并且因此，在C末端酯官能团上水解了9.56当量的肽C末端酯，并且仅0.44当量与肽胺连接以形成产物。可能由于这个原因，在过去的20年中，就诸位发明人所知，subtiligase(而不是stabiligase)在酶促肽合成中已得到工业应用。