[发明专利]通过适体调节的RNA酶P切割调控基因表达

说明书

本公开提供了用于通过靶基因RNA的适体介导的核糖核酸酶切割来调节靶基因表达的多核苷酸构建体，以及使用所述构建体来响应于结合适体的配体的存在或不存在来调节基因表达的方法。所述多核苷酸构建体含有核糖核酸酶底物序列(例如，RNA酶P底物)和包含效应物区和适体的核糖开关，使得当适体结合配体时，发生靶基因表达。

发明领域

本发明提供了用于通过RNA的适体介导的核糖核酸酶切割来调节基因表达的多核苷酸构建体，以及使用所述构建体来响应于结合适体的配体的存在或不存在来调节基因表达的方法。所述多核苷酸构建体含有核糖核酸酶底物序列和包含效应物区和适体的核糖开关，使得当适体结合配体时，发生靶基因表达。

发明背景

核糖核酸酶P(“ RNA酶P”)是核糖核酸蛋白复合物，并且作为内切核糖核酸酶发挥功能，所述内切核糖核酸酶通过催化特定磷酸二酯键的水解从前体tRNA去除5′前导序列以生成成熟tRNA。RNA酶P发现于所有界间的物种中，并且由一种RNA亚基和一种(细菌)或许多(古生菌和真核生物)蛋白构成。对RNA酶P底物识别的研究已揭示，该酶识别底物的结构而不是底物的主要核苷酸序列，并且可以切割含有与前体tRNA的受体茎、T-茎、3'尾序列和5'前导序列等同的结构的模型底物。

靶mRNA的RNA酶P切割已经通过表达外部指导序列(EGS)来完成，所述外部引导序列(EGS)是被设计为与类似于前体tRNA的mRNA靶序列形成杂合复合物的序列。EGS通过碱基配对相互作用结合其mRNA靶标，并指导mRNA靶标的RNA酶P裂解。使用EGS序列来靶向RNA酶P切割需要表达外源EGS序列。

发明概述

在一个方面，本发明提供了用于调控靶基因的表达的多核苷酸盒，其包含与核糖开关连接的RNA酶P底物序列，其中所述核糖开关包含效应物区和适体，其中所述效应物区包含与RNA酶P底物序列的部分互补的序列。在一个实施方案中，所述适体结合小分子配体。

在本发明的实施方案中，所述效应物区包含能够在配体结合适体后形成茎结构的序列，其中效应物区茎为7至12个碱基对。在本发明的实施方案中，所述效应物区茎为7、8、9、10、11或12个碱基对。

在一个实施方案中，所述RNA酶P底物序列包含编码前体tRNA的序列或同源序列。在其他实施方案中，所述RNA酶P靶序列包含编码tRNA、mascRNA、MENβ tRNA-样结构、病毒tRNA-样结构、RNA酶P模型底物的序列和可以起始RNA酶P切割的同源序列。

在一个实施方案中，所述多核苷酸盒的适体序列位于RNA酶P底物序列的5′，且所述效应物区包含与RNA酶P底物的前导序列互补的序列。在一个实施方案中，所述适体序列位于RNA酶P底物序列的5′，且所述效应物区包含RNA酶P底物序列的前导序列的全部或部分和5′受体茎序列的全部或部分。在进一步实施方案中，所述RNA酶P底物的受体茎和核糖开关效应物区被0、1、2、3或4个核苷酸隔开。在其他实施方案中，所述效应物区茎，除了前导序列(及其互补序列)以外，还包括RNA酶P底物的受体茎的一个或多个核苷酸，以及与受体茎的一个或多个核苷酸互补的序列。

在一个实施方案中，所述多核苷酸盒的适体序列位于RNA酶P底物序列的3′，且所述效应物区包含与RNA酶P底物序列的3′受体茎的全部或部分互补的序列。在进一步实施方案中，与RNA酶P底物的3′受体茎互补的效应物区序列为1至7个核苷酸。换言之，所述效应物区茎包括受体茎的1至7个核苷酸，且包括与受体茎的1至7个核苷酸互补的序列。

在一个实施方案中，所述核糖开关位于RNA酶P底物的3′，所以所述RNA酶P底物的效应物区茎和受体茎不重叠。在实施方案中，所述RNA酶P底物的效应物区和受体茎是紧邻的(即，不重叠)。在其他实施方案中，所述RNA酶P底物的效应物区和受体茎被1、2、3、4、5或更多个核苷酸隔开。