[发明专利]高灵敏度DNA甲基化分析方法

说明书

提供了用于扩增一定量的基因组甲基化DNA的方法、组合物和试剂盒，该基因组甲基化DNA可进行随后分析和/或测序。其特别适用于少量DNA，包括但不限于无细胞DNA样品。在一些实施方案中，控制聚合酶和甲基转移酶的比例以提供最大收率。在一些实施方案中，使用双重的引发酶/聚合酶。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年3月8日提交的美国临时专利申请第62/468,907号的优先权，其整体内容通过引用并入此文。

发明背景

本发明是在由美国国立卫生研究院授予的批准号AR048177下利用政府支持完成的。政府拥有本发明的一定权利。

1.技术领域

本发明一般涉及分子生物学。更具体地，在一些实施方案中，本发明涉及用于定量或单碱基分辨率分析有限生物样品中的DNA甲基化(5-甲基胞嘧啶，5mC)的组合物和方法，所述有限生物样品包括来自低细胞数细胞或单细胞的DNA和来自血液或其他体液样品的无细胞DNA(cfDNA)，所述方法在全基因组扩增过程中或在通过定量PCR或高通量测序检测之前扩增特定DNA片段或基因座的过程中使用与链置换DNA聚合酶偶联的DNMT1，以保存5mC信息。

2.背景技术

胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸中胞嘧啶碱基的基因组甲基化是涉及细胞类型特异性转录模式调节的关键表观遗传机制。因此，以单碱基分辨率绘制DNA甲基化组的图谱为表观遗传调控在发育和疾病中的参与提供了许多有力的见解。由于给定群体内细胞的甲基化谱之间通常具有显著的差异程度，来自大量组织样品的信息可能无法解释由细胞间变异引起的表观基因组的组织异质性；因此，大量数据可能掩盖单个细胞对生化过程的不同贡献。因此，以高准确度和CpG覆盖率进行单细胞全甲基化组分析的能力将能够对大量样品进行反卷积，以更深入地研究DNA甲基化发挥作用的各种生物活性，包括但不限于早期胚胎发育和细胞分化、诱导多能干细胞的产生、癌症进展和转移、免疫宿主防御反应和神经元可塑性。

另一方面，源自癌症患者肿瘤的血浆中的循环cfDNA的发现为基于血液的非侵入性癌症检测测试开辟了新的途径。然而，由于从血浆中提取的cfDNA的经降解的小尺寸和低浓度，cfDNA中的5mC模式的表征在技术上的要求一直很苛刻。因此，可测量有限细胞数或甚至单细胞水平的甲基化组测定方法另外可用于表征小的或少量细胞群和DNA的微小样品例如皮克水平量的cfDNA以及来自活组织检查或患者样品的基因组DNA。目前的方法提供了从基因组DNA或cfDNA如实地扩增甲基化组的方法。