[发明专利]高灵敏度DNA甲基化分析方法

权利要求书

1.一种扩增目标甲基化基因组DNA的方法，其包括：

a)使目标甲基化基因组DNA变性；

b)在用于复制所述目标甲基化基因组DNA并产生扩增的基因组甲基化DNA分子的条件下，将所述目标甲基化基因组DNA与聚合酶和甲基转移酶一起孵育；和，

c)分离扩增的基因组甲基化DNA分子。

2.根据权利要求1所述的方法，其中聚合酶单位与甲基转移酶单位的比例为约1:5至约1:20。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述比例为约1单位:15单位。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中与聚合酶和甲基转移酶一起孵育的目标基因组甲基化DNA的量为约5皮克(pg)至约1微克(μg)。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述目标基因组甲基化DNA获自组织样品、血清样品、血液样品、粪便样品、尿液样品、或面颊或口腔拭子。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中变性涉及碱性变性。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述聚合酶为链置换聚合酶。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述聚合酶为Phi29或其衍生物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述甲基转移酶可以在半甲基化DNA上安置5mC以达到完全甲基化状态。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述甲基转移酶是DNMT1。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤b)还包括将所述目标甲基化基因组DNA与包含引发酶和聚合酶双重活性的酶一起孵育，以在复制目标甲基化基因组DNA并产生扩增的基因组甲基化DNA分子的条件期间合成引物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述酶来自嗜热栖热菌。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其还包括在进行步骤b)的孵育之前，制备单独的主混合物以及包含聚合酶和甲基转移酶的酶混合物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述主混合物包含具有引发酶和聚合酶双重活性的酶。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述酶来自嗜热栖热菌。

16.根据权利要求13所述的方法，其中所述酶混合物还包含甲基辅因子。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述甲基辅因子是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。

18.根据权利要求13所述的方法，其中所述主混合物包含dNTP、DNA缓冲液和镁。

19.根据权利要求11至18中任一项所述的方法，其中在将主混合物与酶混合物混合之前，将目标基因组甲基化DNA和随机引物加入到主混合物中。

20.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其还包括在步骤b)的孵育开始超过3小时后加入更多的甲基辅因子。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其还包括使聚合酶和/或甲基转移酶失活。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述基因组甲基化DNA分子来自人类患者。