[发明专利]将衔接子附接至样品核酸的方法

说明书

公开了制备具有单链突出端的双链核酸以便扩增和测序的方法。使平端双链核酸分子与Taq接触导致单核苷酸向核酸的3'末端的非模板指导的添加，其中A被最频繁地添加A，随后是G，随后是C和T。G加尾频繁得足以使得核酸分子与衔接子的连接效率可以通过包括用T和C加尾的衔接子而显著增加。用平端衔接子连接未成功进行加尾的平端核酸分子，连接效率可以甚至进一步增加。

交叉引用

本国际专利申请要求于2017年4月14日提交的美国临时专利申请第62/485,769号、于2017年4月18日提交的美国临时专利申请第62/486,663号和于2017年6月8日提交的美国临时专利申请第62/517,145号的优先权日的权益；并且还要求于2017年4月14日提交的国际专利申请PCT/US2017/027809的优先权日的权益，每个专利申请为了所有目的通过引用以其整体并入。

序列表

本申请包括2018年4月10日创建的1千字节的txt文件512837-ST25内的序列，其通过引用并入。

背景

癌症是世界范围疾病的主要原因。每年，全世界有数千万人被诊断为患有癌症，并且多于一半最终因其死亡。在许多国家，癌症列为继心血管疾病之后的第二大最常见死亡原因。对于许多癌症，早期检测与改善的结果相关。

癌症通常通过对肿瘤进行活检，随后分析细胞、标志物或从细胞提取的DNA来检测。但是最近已经提出，癌症也可以通过体液，诸如血液或尿液中的无细胞核酸来检测(参见，例如，Siravegna等人，Nature Reviews2017)。这样的测试具有的优点是，它们是非侵入性的并且可以在不鉴定待活检的可疑癌细胞的情况下进行。然而，体液中的核酸的量非常低。因此，这样的分析需要有效的将体液中的天然无细胞DNA转化为易于分析的形式的方法。

从患者的样品中制备用于分析的DNA分子通常包括先修复单链突出端，以允许连接至衔接子以便扩增和测序。修复可以通过消化突出链或延伸相对链以产生平端，随后使5'末端磷酸化并平端连接至衔接子来实现。可选择地，在平端化之后，平端可以用Taq聚合酶进行A加尾。将A加尾的片段与在3'末端包含单核苷酸T尾的衔接子退火并连接。此构型有利于期望的衔接子-DNA分子连接，但对于在其中仅有少量核酸可用的样品，该样品中的DNA分子向可被测序的分子的总体转化效率可能仍然低得不可接受。

概述

本发明提供了制备用于分析的核酸的方法，所述方法包括：(a)通过提供5'-3'聚合酶活性和3'-5'校正活性的一种或更多种酶以及四种标准类型核苷酸的作用，使样品中具有单链突出端的双链核酸平端化，其中伴随在5'末端的单链突出端用作通过聚合酶活性延伸互补链的模板，并且伴随在3'末端的单链突出端被产生平端核酸的校正活性消化；(b)在不将平端核酸与样品的其他组分分离的情况下，通过无3'-5'校正功能的聚合酶的作用对平端核酸进行末端加尾，该无3'-5'校正功能的聚合酶进行核苷酸向平端核酸的3'末端的非模板指导的添加，其中A优先于G被添加，G优先于C或T被添加；(c)使来自步骤(c)的核酸与在3'末端具有单核苷酸T或C突出端的至少部分双链的衔接子退火，；以及(d)将核酸连接至衔接子。任选地，该方法还包括在步骤(a)之后将一种或更多种酶变性。任选地，该方法还包括使样品与一种或更多种酶、四种标准类型核苷酸和无3'-5'校正功能的聚合酶接触。任选地，样品与一种或更多种酶、四种标准类型核苷酸和无3'-5'校正功能的聚合酶一起接触。任选地，步骤(b)在比步骤(a)更高的温度进行。任选地，步骤(a)在环境温度进行，并且步骤(b)在超过60℃的温度进行。任选地，一种或更多种酶是具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'校正活性的聚合酶。任选地，无3'-5'校正功能的聚合酶是热稳定聚合酶，并且该方法还包括在步骤(a)之后升高样品的温度，以使具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'校正活性的聚合酶失活。任选地，该方法还包括(e)扩增连接至衔接子的核酸；和(f)分析该核酸。