[发明专利]将衔接子附接至样品核酸的方法

权利要求书

1.一种制备用于分析的核酸的方法，所述方法包括：

(a)通过提供5'-3'聚合酶活性和3'-5'校正活性的一种或更多种酶以及四种标准类型核苷酸的作用，使样品中具有单链突出端的双链核酸平端化，其中伴随在5'末端的单链突出端用作通过所述聚合酶活性延伸互补链的模板，并且伴随在3'末端的单链突出端被产生平端核酸的所述校正活性消化；

(b)在不将所述平端核酸与所述样品的其他组分分离的情况下，通过无3'-5'校正功能的聚合酶的作用对所述平端核酸进行末端加尾，所述无3'-5'校正功能的聚合酶进行核苷酸向所述平端核酸的3'末端的非模板指导的添加，其中A优先于G被添加，G优先于C或T被添加；

(c)使来自步骤(c)的核酸与在3'末端具有单核苷酸T或C突出端的至少部分双链的衔接子退火；以及

(d)将所述核酸连接至所述衔接子。

2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括在步骤(a)之后将所述一种或更多种酶变性。

3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括使所述样品与所述一种或更多种酶、所述四种标准类型核苷酸和所述无3'-5'校正功能的聚合酶接触。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述样品与所述一种或更多种酶、所述四种标准类型核苷酸和所述无3'-5'校正功能的聚合酶一起接触。

5.如任一前述权利要求所述的方法，其中步骤(b)在比步骤(a)更高的温度进行。

6.如权利要求5所述的方法，其中步骤(a)在环境温度进行，并且步骤(b)在超过60℃的温度进行。

7.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述一种或更多种酶是具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'校正活性的聚合酶。

8.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述无3'-5'校正功能的聚合酶是热稳定聚合酶，并且所述方法还包括在步骤(a)之后升高所述样品的温度，以使所述具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'校正活性的聚合酶失活。

9.如任一前述权利要求所述的方法，所述方法还包括(e)扩增连接至所述衔接子的所述核酸；和(f)分析所述核酸。

10.如任一前述权利要求所述的方法，所述方法还包括使所述样品与至少部分双链的平端衔接子接触，所述至少部分双链的平端衔接子在连接步骤中与平端双链核酸连接，所述平端双链核酸未经历核苷酸向3'末端的非模板指导的添加。

11.如权利要求7所述的方法，其中所述具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'校正活性的聚合酶是T4聚合酶或Klenow大片段。

12.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述无3'-5'校正功能的聚合酶是Taq聚合酶。

13.如任一前述权利要求所述的方法，其中至少步骤(a)-步骤(d)在单个管中进行。

14.如任一前述权利要求所述的方法，其中对于至少步骤(a)-步骤(d)，没有组分被从所述样品中去除。

15.如权利要求9所述的方法，其中步骤(a)-步骤(e)在单个管中进行。

16.如任一前述权利要求所述的方法，其中具有单核苷酸T的至少部分双链的衔接子与具有单核苷酸C的至少部分双链的衔接子的摩尔比为4:1至2:1。

17.如权利要求16所述的方法，其中平端衔接子与加尾的衔接子的摩尔比为1:5至1:500。