[发明专利]一种体外糖基工程化红细胞生成刺激蛋白的方法

说明书

本发明涉及一种体外生产糖基工程化的红细胞生成刺激蛋白的方法，包括以下步骤：提供不含唾液酸的红细胞生成刺激蛋白、用N‑乙酰基‑葡萄糖胺转移酶B3GNT2处理红细胞生成刺激蛋白、用半乳糖基转移酶处理红细胞生成刺激蛋白、和用唾液酸转移酶处理红细胞生成刺激蛋白。

技术领域

本发明涉及体外糖基工程化(glycoengineered)的红细胞生成刺激蛋白、产生所述红细胞生成刺激蛋白的方法及其用途。

背景技术

红细胞生成刺激蛋白是包含几个N-糖基化位点的糖蛋白。蛋白质上聚糖模式的变异对蛋白质功能具有重要意义。例如，蛋白质上N-连接的聚糖结构可影响各种特征，包括蛋白酶易感性、细胞内运输、分泌、组织靶向、生物半衰期和细胞或生物体中蛋白质的抗原性。这些特征中的一种或多种的改变极大地影响蛋白质在其天然环境中的功效，并且在为治疗剂的目的生产肽的情况下，其还影响蛋白质作为治疗剂的功效。

红细胞生成素(EPO)是具有三个N-糖基化位点和一个O-糖基化位点的糖蛋白。已经使用重组DNA技术生物合成制备红细胞生成素(Egrie,J C,Strickland,T W,Lane,J等人(1986)Immunobiol.72:213–224)，其是插入中国仓鼠的卵巢组织细胞(CHO细胞)中并在其中表达的克隆人EPO基因的产物。人红细胞生成素(hEPO)的主要、完全加工形式的一级结构如图1所示。有两个二硫键；在Cys7-Cys161和Cys29-Cys33之间。不含糖部分的EPO多肽链的分子量为18,236Da。在完整的EPO糖蛋白中，大约40％的分子量由碳水化合物基团所占，所述碳水化合物基团在蛋白质糖基化位点上的糖基化蛋白质(Sasaki,H,Bothner,B,Dell,Aand Fukuda,M(1987)J.Biol.Chem.262:12059)。

EPO的典型N-聚糖包括具有一个或两个N-乙酰基乳糖胺重复的双、三和四触角结构(参见例如Postnikov等人2016Russ.Chem.Rev.85 99)。

已知与较少唾液酸化的EPO糖蛋白相比，EPO的N-聚糖上更多数量的末端唾液酸部分与更高的EPO比活性相关(参见例如Imai等人,Eur.J.Biochem.194(1990)，第457-462页)。EPO的去唾液酸化降低了EPO在循环中的半衰期(Ridley等人J Natl MedAssoc.1994Feb；86(2):129-35)。

据报道，更多数量的聚-N-乙酰基乳糖胺重复或更多数量的EPO的N-聚糖分支都分别与EPO更高的比生物学活性相关(参见例如WO 99/28346)。

已知使用基因工程化的宿主细胞修饰EPO的聚糖模式以产生EPO，例如WO 99/28346。

提出了在体外修饰糖蛋白聚糖模式的方法，即生产后修饰聚糖模式。EP 2661492公开了一种改善α-2,6-唾液酸化聚糖的含量的方法。EP 2664192公开了通过增加聚-N-乙酰基乳糖胺的数量可以增加糖蛋白的循环时间，其建议使用β3-N-乙酰基-葡萄糖胺转移酶家族成员(B3GNT1、2、3、4)来实现聚-N-乙酰基乳糖胺的数量增加。

WO 2008/57683公开了一种纯化EPO的方法。其建议在体外使用N-乙酰基-葡萄糖胺转移酶和半乳糖基转移酶重构EPO的聚糖模式，以形成糖基化的EPO多肽，其具有至少一个具有末端-GlcNAc-Gal部分的聚糖残基，优选在单触角分支上。