[发明专利]改进的表观遗传免疫细胞计数方法

说明书

本发明涉及改进的表观遗传血液和免疫细胞计数方法以及各自的应用和试剂盒。

本发明涉及改进的表观遗传血液和免疫细胞计数方法以及各自的应用和试剂盒。

发明背景

偏离细胞免疫系统的生理平衡指示各种疾病，并因此构成了诊断和患者监测的重要度量。目前流式细胞术(FCM)是进行相应测量的最佳方法，其提供了关于待测定的细胞类型的准确性和灵活性(1)。然而，尽管诊断实验室中使用的血液学分析仪较先进且物流环境广泛适应所需的流程，但这种方法的适用性有限。

基于FCM的细胞计数需要具有完整白细胞的新鲜、抗凝血或保存良好的血液样品。即使利用新鲜的样品，仍建议快速工作，因为分析时间会影响血液抽取后最初几小时开始的细胞恶化的结果。此外，由于生物学、技术和操作的变化，FCM的标准化仍然是一项重大挑战(2,3,4,5)，且尚未实现完全标准化的测量(6,7)。然而，最关键的挑战是，并非所有医疗应用都保证可获得新鲜或保存良好的血液样品，在这些情况下不能应用流式细胞术。

例如，对HIV感染患者的治疗决定取决于患者的CD4⁺T辅助细胞计数。在低于500个T辅助细胞/微升的频率下，强烈建议进行抗逆转录病毒治疗，并且在低于200个细胞/微升的水平下是必要的。在资源贫乏的国家，不能频繁连续进行血液抽取和测量的农村地区，适当的诊断评估常常受到阻碍。因此，通常仅基于HIV相关的临床症状开始治疗，这可能导致不理想的结果(8,9)。

另一个实例是新生儿筛查。收集来自脚跟穿刺的Guthrie卡，并用于检测严重的、可治愈的先天性缺陷。这些卡不能用于流式细胞术分析，相反T细胞受体切除环(TREC)被用于PID筛选。TREC分析优先检测新胸腺迁出细胞(新生儿外周血中主要的T细胞亚型)。然而，该技术仅限于T-(KREC)细胞以及最近的B-(KREC)细胞，但不适合诸如CD4或CD8亚群的鉴别分析，并且也不能检测其他细胞类型，如NK细胞。因此，新生儿分析中的TREC分析仅用于初步筛查。在治疗性造血干细胞移植之前和之后的鉴别诊断和患者监测需要改变技术并且通过流式细胞术进行。

为了克服诊断限制和相关的技术转换，改进的免疫状态评估方法将是有价值的。其应当稳健地提供相对和绝对细胞计数，同样允许使用新鲜的、冷冻的或纸斑点的(paper-spotted)血液。对于每个分析的细胞，信号应该是数字化的，即，每个细胞指示一个正值或负值，而不需要任意定义“阳性”阈值。这样的新方法同样应当以自动化的、独立于操作者的方式进行，并且较少依赖于所使用的试剂如抗体的变化。

在本发明的第一个方面，以上目标通过血液免疫细胞的定量甲基化测定方法得到解决，其包括以下步骤：

a)提供确定量的人血液样品，其包含待定量的血液免疫细胞的二倍体基因组DNA；

b)提供经计算机模拟的重亚硫酸盐转化的重组核酸，其包含至少一个脱甲基化标准基因和所述至少一个脱甲基化标准基因的所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列(“标准物I”)；

c)提供重组核酸，其包含b)所述的至少一个脱甲基化标准基因和b)所述的至少一个脱甲基化标准基因的所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列的脱甲基化的基因组序列(“校准物I”)；

d)提供重组核酸，其包含b)所述的至少一个脱甲基化标准基因的所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列(“标定物I”)；

e)向a)所述的样品添加确定量的d)所述的重组核酸(“加标”)；

f)利用重亚硫酸盐处理a)所述的待定量的细胞的二倍体基因组DNA以及c)和d)所述的重组核酸，以将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶；

g)使用适当的引物对扩增a)、b)、c)和f)所述的核酸分子，以产生扩增子；以及

h)基于分析所述扩增子确定每个体积样品的血液免疫细胞(BIC)。