[发明专利]改进的表观遗传免疫细胞计数方法

权利要求书

1.血液免疫细胞的定量甲基化测定方法，其包括以下步骤：

a)提供确定量的人血液样品，其包含待定量的血液免疫细胞的二倍体基因组DNA；

b)提供经计算机模拟的重亚硫酸盐转化的重组核酸，其包含至少一个脱甲基化标准基因和所述至少一个脱甲基化标准基因的所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列(“标准物I”)；

c)提供重组核酸，其包含b)所述的至少一个脱甲基化标准基因和b)所述的至少一个脱甲基化标准基因的所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列的脱甲基化的基因组序列(“校准物I”)；

d)提供重组核酸，其包含b)所述的至少一个脱甲基化标准基因的所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列(“标定物I”)；

e)向a)所述的样品添加确定量的d)所述的重组核酸(“加标”)；

f)利用重亚硫酸盐处理a)所述的待定量的细胞的二倍体基因组DNA以及c)和d)所述的重组核酸，以将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶；

g)使用适当的引物对扩增a)、b)、c)和f)所述的核酸分子，以产生扩增子；以及

h)基于分析所述扩增子确定每体积样品的血液免疫细胞(BIC)。

2.血液细胞的定量甲基化测定方法，其包括以下步骤：

a)提供人血液样品，其包含待定量的血液细胞的二倍体基因组DNA；

b)提供经计算机模拟的重亚硫酸盐转化的重组核酸，其包含至少一个脱甲基化标准基因和至少一个血液细胞特异性基因(“标准物II”)；

c)提供重组核酸，其包含b)所述的至少一个脱甲基化标准基因和b)所述的至少一个血液细胞特异性基因的脱甲基化的基因组序列(“校准物II”)；

d)利用重亚硫酸盐处理a)所述的待定量的细胞的二倍体基因组DNA和c)所述的重组核酸，以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；

e)使用适当的引物对扩增a)、b)、c)和d)所述的核酸分子，以产生扩增子；以及

f)基于分析所述扩增子确定每种所有细胞的脱甲基化百分比(DDC)。

3.确定免疫细胞类型的甲基化基因的绝对拷贝数的方法，其包括：

a)实施权利要求1所述的方法，

b)实施权利要求2所述的方法，以及

c)将所确定的BIC与所确定的DDC相乘。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述血液免疫细胞选自：白细胞、T-淋巴细胞、粒细胞、单核细胞、B-淋巴细胞和/或NK细胞。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述重组核酸分子选自：质粒、酵母人工染色体(YAC)、人类人工染色体(HAC)、PI来源的人工染色体(PAC)、细菌人工染色体(BAC)和PCR产物。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述脱甲基化标准基因选自在待检测的所有细胞中表达的基因如，例如看家基因，如，例如GAPDH。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述血液细胞特异性基因选自在待检测的所有血液细胞中表达的基因如，例如CD4。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述血液样品选自：外周血、毛细血管血或静脉血样品或以上的部分如，例如外周血单核细胞，血块和干血斑。

9.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其还包括基于所述定量推断哺乳动物的免疫状态的步骤。

10.诊断试剂盒，其包含用于实施权利要求1-9中任一项所述方法的材料，任选地，以及使用说明书。

11.权利要求10所述的试剂盒用于实施权利要求1-3中任一项所述的方法的用途。