[发明专利]一种去氢表雄酮的制备方法及其制备用酶

说明书

本发明提供了一种去氢表雄酮的制备方法，包括：在保护气氛下，向叔丁醇中加入叔丁醇钾，搅拌均匀后加入4‑雄烯二酮得到混合料，将所述混合料滴加至含有抗坏血酸钠的乙酸溶液中反应得到5‑雄烯二酮；将所述5‑雄烯二酮溶于有机溶剂中，并添加酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和氧化还原辅酶得到混合液，控制所述混合液的pH为6.0‑6.3，于22‑26℃下搅拌反应1‑6小时后得到反应液，将所述反应液分离提纯后得到去氢表雄酮，所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶由微生物菌株共表达产生并以粗酶液形式添加。该制备方法合成工艺步骤少，操作简单，产率高，成本低，可以广泛适用于工业化规模生产。本发明还提供了一种制备用酶。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种去氢表雄酮的制备方法及其制备用酶。

背景技术

去氢表雄酮(脱氢表雄酮)(dehyroepiandrosterone，DHEA)是一种C19类固醇载体化合物，化学名称为3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮，分子式C₁₉H₂₈O₂。DHEA是人血浆中大量共存在的肾上腺甾体化合物，具有抗炎、抗增殖及抗抑郁等活性，其衍生物在实验中能促进动物免疫应答，而且具有很好的神经保护作用。此外，DHEA还是合成甾体药物的重要中间体。近几年来，DHEA凭借其重要研究价值，已逐渐发展成为最具热门的研究对象之一。

传统的DHEA的合成大多采用化学方法，例如以孕甾双烯醇酮或醋酸妊娠双烯醇酮为原料，经过肟化、重排与水解后得到产物。然而所述合成方法分3步以上化学反应完成，原料价格高昂，并且工艺中使用苯、卤代烷或吡啶等溶剂，对环境伤害较大。此外，传统工艺中的产品纯度低、效率低，后期提纯操作繁琐。

因此，开发一种步骤少、成本低、产率高且绿色环保的DHEA合成方法具有重要意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种去氢表雄酮的制备方法及其制备用酶，所述去氢表雄酮的制备方法共涉及二步反应，大大缩少了传统方法制备过程中繁多的合成步骤，同时本发明提供的制备用酶使所述去氢表雄酮的合成工艺具备高收率、低成本且绿色环保的特点。

第一方面，本发明提供了一种去氢表雄酮的制备方法，包括：

(1)在保护气氛下，向叔丁醇中加入叔丁醇钾，搅拌均匀后加入4-雄烯二酮得到混合料，将所述混合料滴加至含有抗坏血酸钠的乙酸溶液中反应得到5-雄烯二酮；

(2)将步骤(1)中所述5-雄烯二酮溶于有机溶剂中，并添加酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和氧化还原辅酶得到混合液，控制所述混合液的pH为6.0-6.3，于22-26℃下搅拌反应1-6小时，得到反应液，将所述反应液分离提纯后得到去氢表雄酮，所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶由微生物菌株共表达产生并以粗酶液形式添加，所述酮还原酶的来源于领地伯克霍尔德菌属、红球菌属和鞘氨醇单胞菌属中的一种或多种。

本发明中，所述去氢表雄酮的制备方法的具体工艺路线如下所示：

其中，所述工艺中共包括两步反应，第一步为化学法，第二步为生物酶法，所述4-雄烯二酮(4-Androstene-3,17-dione，4-AD)如所式(Ⅰ)所示，所述5-雄烯二酮(5-Androstene-3,17-dione，5-AD)如式(Ⅱ)所示，所述去氢表雄酮如式(Ⅲ)所示。

可选地，所述步骤(1)中，所述保护气氛是指所述充满氮气或惰性气体的环境下。所述惰性气体包括氦(He)、氖(Ne)、氩(Ar)、氪(Kr)和氙(Xe)中的一种或多种。