[发明专利]一种去氢表雄酮的制备方法及其制备用酶

权利要求书

1.一种去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，包括：

(1)在保护气氛下，向叔丁醇中加入叔丁醇钾，搅拌均匀后加入4-雄烯二酮得到混合料，将所述混合料滴加至含有抗坏血酸钠的乙酸溶液中反应得到5-雄烯二酮；

(2)将步骤(1)中所述5-雄烯二酮溶于有机溶剂中，并添加酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和氧化还原辅酶得到混合液，控制所述混合液的pH为6.0-6.3，于22-26℃下搅拌反应1-6小时，得到反应液，将所述反应液分离提纯后得到去氢表雄酮，所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶由微生物菌株共表达产生并以粗酶液形式添加，所述酮还原酶的来源于领地伯克霍尔德菌属、红球菌属和鞘氨醇单胞菌属中的一种或多种。

2.如权利要求1所述的去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述混合料的具体制备过程包括：在室温下向叔丁醇中加入叔丁醇钾，然后升温至55-65℃，搅拌0.3-0.8小时至所述叔丁醇钾完全溶解后，将温度维持在25-30℃下，加入4-雄烯二酮搅拌0.3-0.8小时后，冷却得到所述混合料。

3.如权利要求1所述的去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述将所述混合料滴加至含有抗坏血酸钠的乙酸溶液中反应得到5-雄烯二酮的过程中，反应温度为25-30℃，反应时间为0.3-0.8小时。

4.如权利要求1所述的去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述微生物菌株包括Rosetta大肠杆菌和BL21大肠杆菌中的一种或两种。

5.如权利要求1所述的去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述微生物菌株共表达产生所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶的具体过程包括：构建一重组表达质粒，将所述重组表达质粒转染至所述微生物菌株内后，在微生物培养液中诱导含有所述重组表达质粒的微生物菌株表达所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶，其中所述重组表达质粒包括所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶的基因编码序列。

6.如权利要求1或5所述的去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，所述酮还原酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列中的任意一种；所述葡萄糖脱氢酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

7.如权利要求1所述的去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述氧化还原辅酶包括NAD⁺、NADP⁺、NADH和NADPH中的一种或多种。

8.一种酮还原酶，其特征在于，所述酮还原酶包括酮还原酶KRED3、酮还原酶KRED4和酮还原酶KRED5中的一种或多种，所述酮还原酶KRED3的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述酮还原酶KRED4的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述酮还原酶KRED5的基因编码序列包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

9.一种酮还原酶在催化酮或醛转化为手性醇中的应用，其特征在于，所述酮还原酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列中的任意一种。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述催化酮或醛转化为手性醇中的应用包括催化5-雄烯二酮转化为去氢表雄酮中的应用。