[发明专利]一种细胞冻存液及其应用

说明书

本发明涉及细胞领域，特别涉及细胞冻存液，及其应用。所述细胞冻存液由渗透性保护剂、非渗透性保护剂、提供能量的试剂等混合物构成。可应用于贴壁细胞及悬浮细胞的冻存和临床应用细胞的冻存。细胞在该细胞冻存液中冻存复苏后培养的存活率在98％以上，细胞的各项指标检测显示其功能保持完好，这表明本发明的细胞冻存液可以很好地保持细胞的生理学功能，无变异、无致瘤性等。本发明的细胞冻存液配制步骤简单、易于操作、应用范围广、便于研究及临床推广使用。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种细胞冻存液及其应用。

背景技术

在细胞培养的传代及日常维持过程中，细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。把细胞储存在液氮中，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样可以在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。

细胞冻存方法往往存在细胞复苏活率低、状态差等问题。液氮冷冻保存细胞不当，会使细胞内外的水分很快形成冰晶，引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。

本发明应用渗透性保护剂和非渗透性保护剂，结合了两者的优势。与单独使用渗透性保护剂相比能更大程度的减少细胞在冻存、复苏时的损伤。细胞冻存采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。加适量的海藻糖、葡聚糖等非渗透性的保护液，它可与渗透作用、细胞膜磷脂、不稳定蛋白的特异性相互作用，防止它们因干燥和氧化应激而受损和变性。复苏细胞时采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。在细胞冻存中使用渗透性保护剂和非渗透性保护剂，两者协同作用，减少了细胞内冰晶的形成同时抑制细胞外结冰，保护细胞膜，从而减少冰晶对细胞造成的损伤。该冻存液适用于贴壁细胞及悬浮细胞，如脂肪间充质干细胞、成纤维细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐血间充质干细胞、骨髓间充质干细胞等、NK细胞、CIK细胞、DC细胞、CAR-T细胞等。而且冻存复苏后细胞存活率在98％以上，经细胞特性分析、功能性分析和安全性等方面测定，显示细胞冻存后功能保持完好、无变异、无致瘤性，适用于各种临床应用细胞的冻存使用。

发明内容

本发明目的在于提供一种配制步骤简单、易于操作、应用范围广、便于研究及临床推广使用，冻存后复苏成活率高的细胞冻存液。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

细胞冻存液由渗透性保护剂：二甲基亚砜、甘油等；非渗透性保护剂：葡聚糖、海藻糖等；提供能量类试剂：人血白蛋白、马血清、胎牛血清、小牛血清；余量为培养基，如DMEN培养基、无血清培养等组成。

所述的渗透性保护剂二甲基亚砜的体积百分含量为9％～15％，所述的非渗透性保护剂海藻糖或葡聚糖的体积百分含量为0.5％～1％，所述的提供能量类试剂人血白蛋白的体积百分含量为1％～5％，所述的马血清、胎牛血清或小牛血清的体积百分含量为10％～20％，余量为DMEN培养基或无血清培养基等。

申请人发现各组分的浓度在该范围内，其细胞复苏后活力在98％以上。

一种细胞冻存液的制备方法，在DMEM培养基中加入人血白蛋白、胎牛血清或马血清、葡聚糖、海藻糖、二甲基亚砜。