[发明专利]一种去除生物样品中无核红细胞的试剂及在DNA提取中应用

说明书

本发明涉及一种去除生物样品中无细胞核红细胞的裂解试剂以及在DNA提取中的应用。该去除红细胞的裂解试剂包含金属离子螯合剂、无机盐、表面活性剂以及溶液缓冲体系。本发明还提供了所述裂解试剂在DNA提取中的应用方法。采用本发明提供的无核红细胞裂解试剂，克服了现有产品稳定性差、需要冷藏保存以及取出需要预热使用的缺点，可有效裂解去除人、鼠等血液样品或组织细胞样品中的红细胞，并分离富集样品中的有核细胞，用于有核细胞的核酸（DNA）提取，具有试剂组分稳定、安全环保，红细胞裂解效率高、操作快速简便的优点；试剂能在常温长期储存、无需冷链运输，配制和使用成本均较低。

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及去除生物样品中无核红细胞的裂解试剂及其在DNA提取中的应用。

背景技术

红细胞或红血球（Red Blood Cell，RBC）是血液中数量最多的一种血细胞，同时也是脊椎动物体内通过血液运送氧气的最主要的媒介，并具有免疫功能。哺乳类脊椎动物（除骆驼和羊驼外）循环血中成熟的红细胞没有细胞核与DNA；而鸟禽类脊椎动物红细胞有细胞核与DNA，正常成人红细胞总数为（3.5～5.5）x 10⁹个/ml。白细胞或白血球（Leukocyte，White Blood Cell，WBC）是血液中无色、球形、有细胞核与DNA的血细胞，在哺乳动物体内主要起防卫作用，参与机体的免疫防御反应，正常成人白细胞总数为（4.0～10.0）x 10⁶个/ml。在生物化学、分子生物学实验中，从外周血中分离有核白细胞、从脐带血中分离干细胞、以及小鼠等脾细胞的分离时需要去除红细胞，以便用于后续核酸或蛋白提取和分析检测，以及后续细胞原代培养或细胞融合等操作。

目前常用的有核细胞分离方法有：（1）Ficoll、Percoll密度梯度离心法，虽然目前公认去除红细胞好、能纯净分离出单核细胞，但是使用的淋巴细胞分离液试剂体积较大、操作繁琐耗时；（2）氯化铵裂解红细胞法，使用方便但去除红细胞效果不佳、需要反复洗涤，同时氯化铵溶液热稳定性差、需要现用现配或者低温冷藏保存/运输。例如，发明专利“一种红细胞裂解液及其裂解方法”（CN104178244A）公开了所用的红细胞裂解液含有氯化铵、碳酸氢钾、乙二胺四乙酸二钠等组分，使用时与全血需要混合15～30min，裂解效果不佳、且非常耗时，同时裂解液中氯化铵和碳酸氢钾组分都属于热不稳定组分，只能过滤除菌和冷藏保存，使用前还需要预热，其配制、使用和保存都不方便。发明专利“一种体外分离有核细胞且能去除红细胞的方法和试剂盒”（CN102747035A）也公开的红细胞裂解液由氯化铵和Tris-HCl组成，而发明专利“提取DNA的试剂及使用该试剂提取哺乳动物DNA的方法”（CN1635134A）公开的红细胞裂解液含有Tris-HCl、氯化镁和氯化钠，存在红细胞裂解不完全、有核细胞纯度低、操作时间长等不足。这些公开的红细胞裂解液的缺点将对后续有核细胞DNA提取或培养等造成不利影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种去除生物样品中无细胞核红细胞的裂解试剂，红细胞裂解试剂含有以下组分：金属离子螯合剂、无机盐、表面活性剂以及溶液缓冲体系，试剂中的金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸钠（Edetate tetrasodium，EDTA）或次氮基三乙酸钠（nitrilotriacetic acid trisodium，NTA）、浓度为1～5mmol/L，无机盐为氯化钠（NaCl）或氯化钾（KCl）、浓度为15～50mmol/L，表面活性剂为曲拉通X-100（Triton X-100）或吐温20（Tween 20）、浓度为0.3～0.8%（v/v），溶液缓冲体系为三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液、浓度为5～20mmol/L、pH范围为7.5～8.0。

本发明提供了无细胞核红细胞裂解试剂的使用方法，将全血或组织细胞样品和红细胞裂解液按1:2～1:5的比例混合1min，无核红细胞在溶液低渗环境和表面活性剂作用下破裂，离心弃上清，在富集的有核细胞沉淀中加入1～2ml红细胞裂解试剂，混匀重悬沉淀，离心弃上清后即获得完全去除红细胞的有核细胞富集沉淀，可用于下游DNA提取或细胞培养操作。