[发明专利]小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性基因MAP4K4的启动子及其应用

说明书

本发明公开了一种小菜蛾Bt Cry1Ac杀虫蛋白抗性基因MAP4K4表达调控的核心启动子序列和突变位点及其在小菜蛾Bt Cry1Ac杀虫蛋白抗性鉴定和田间监测中的应用。所述突变位点位于起始密码子ATG上游的491、474、469‑470位核苷酸，分别命名为M1、M2、M3。小菜蛾Bt Cry1Ac杀虫蛋白敏感种群启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，抗性近等基因系种群启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。实验证明，M2与M3同时突变时，MAP4K4基因启动子活性显著增强。本发明推动了启动子突变在昆虫Bt抗性领域的研究，尤其在昆虫Bt抗性田间检测和治理方面有重要的理论和实践意义。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及小菜蛾Bt抗性关键基因MAP4K4基因的核心启动子及应用。

背景技术

小菜蛾Plutella xylostella(L.)，属鳞翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，是世界上重要的农业害虫，主要为害十字花科蔬菜和作物。小菜蛾个体小，世代周期短，繁殖能力强，主要在幼虫期钻入叶肉取食为害蔬菜，形成空洞和缺刻，影响蔬菜品质和产量，为害严重时可造成蔬菜减产90％以上，甚至绝收。目前，全世界范围内每年对小菜蛾的防治费用高达40-50亿美元。小菜蛾之所以能产生如此严重的危害主要是因为其对各种化学杀虫剂均产生了不同程度的抗药性，田间防治极其困难。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种昆虫病原微生物，为革兰氏阳性细菌，它能产生多种Cry、Cyt和Vip类杀虫蛋白。Bt的杀虫谱广，它能有效防治以鳞翅目、鞘翅目和双翅目的多种害虫。随着Bt制剂的大量使用及Bt转基因作物的大面积种植，多种昆虫对Bt进化产生了高抗性。小菜蛾是世界上第一个报道对Bt产生抗药性的田间害虫，其抗性问题尤为突出，因此，研究小菜蛾Bt抗性机制显得尤为重要和迫切。

MAP4K4基因属于有丝分裂原激活的蛋白酶(Mitogen-activated proteinkinase,MAPK)信号途径四级信号级联放大反应网络(MAP4K-MAP3K-MAP2K-MAPK)最上游的MAP4K家族，它能磷酸化激活此复杂的信号通路，通过调控多种转录因子，从而调控不同靶标基因的表达水平从而发挥其相应的生物学功能。MAPK信号途径的激活可以作为昆虫对Bt的防御反应，本实验室前期研究表明，在小菜蛾中，MAP4K4可以作为ALP和ABCC基因差异表达的开关，MAPK信号途径中转录激活的MAP4K4基因能反式调控PxmALP和PxABCC1-3基因的表达量，从而最终导致小菜蛾对Bt Cry1Ac杀虫蛋白产生抗性。该研究结果加深了我们对昆虫是如何通过精细化的细胞反应防御Bt Cry杀虫蛋白并最终导致抗性的产生整个过程的认识。在该研究中，小菜蛾Bt抗性种群中MAP4K4基因表达量明显组成型升高，而非诱导型升高，这表明MAP4K4基因在Bt抗性小菜蛾体内存在稳定的转录激活机制(Guo et al.,MAPKsignaling pathway alters expression of midgut ALP and ABCC genes and causesresistance to Bacillus thuringiensis Cry1Ac toxin in diamondback moth,PLoSGenetics,2015,11(4):e1005124)。然而，目前MAP4K4基因的转录水平过量表达的分子调控机制仍不清楚。