[发明专利]小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性基因MAP4K4的启动子及其应用

权利要求书

1.一种小菜蛾Bt抗性相关的MAP4K4基因核心启动子，其特征在于，其核苷酸序列为SEQID NO. 1所示。

2.一种小菜蛾Bt Cry1Ac杀虫蛋白抗性近等基因系种群(NIL-R)启动子，其特征在于，其核苷酸序列SEQ ID NO. 2所示。

3.一种活性显著增强的小菜蛾Bt抗性相关的MAP4K4基因核心启动子，其特征在于，相对于敏感小菜蛾MAP4K4基因核心启动子存在下述一种或多种突变： M2：-474位由C突变为T、M3：-469和-470位由TA突变为AT，其中，所述活性显著增强的小菜蛾Bt抗性相关的MAP4K4基因核心启动子核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

4.如权利要求3所述的活性显著增强的小菜蛾Bt抗性相关的MAP4K4基因核心启动子，其特征在于，所述突变同时为M2：-474位由C突变为T、M3：-469和-470位由TA突变为AT。

5.一种检测小菜蛾对Bt Cry1Ac杀虫蛋白抗性的方法，其特征在于：检测Bt抗性相关的MAP4K4基因启动子是否存在下述突变，即下述一种或多种突变： M2即-474位由C突变为T、M3即-469和-470位由TA突变为AT，其中，所述Bt抗性相关的MAP4K4基因核心启动子核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：构建不同长度以及具有敏感和抗性的pGL4.10-MAP4K4双荧光素酶报告基因表达系统载体，分别转染果蝇S2细胞及活性检测，确定MAP4K4基因的核心启动子区；通过对MAP4K4基因核心启动子测序比较分析，检测Bt抗性相关的MAP4K4基因启动子是否存在下述突变，即下述一种或多种突变： M2即-474位由C突变为T、M3即-469和-470位由TA突变为AT。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于该方法的步骤如下：

小菜蛾基因组DNA提取；

小菜蛾MAP4K4基因启动子的克隆及活性分析，利用小菜蛾基因组数据库获得MAP4K4基因起始密码子ATG上游核苷酸序列，预测该基因的启动子区，为进一步验证启动子活性，确定核心启动子区，采用渐进截短序列的方法构建不同长度的pGL4.10载体，并转染至S2细胞，用双荧光素酶报告基因表达系统分析不同片段的启动子活性，最终确定MAP4K4基因的核心启动子区位于ATG上游504 bp以内；

MAP4K4基因核心启动子功能性SNP位点检测，设计Overlap引物将抗性基因各突变位点分别或多个位点同时回复突变至敏感种群基因的核苷酸类型，检测启动子活性变化。

8.一对扩增MAP4K4核心启动子的引物序列，其特征在于，上游引物序列为：SEQ ID NO.3所示，下游引物序列为：SEQ ID NO. 4所示，其中，所述MAP4K4核心启动子核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

9.一对构建MAP4K4核心启动子表达载体的引物序列，其特征在于，上游引物序列为：SEQ ID NO. 5所示，下游引物序列为：SEQ ID NO. 6所示，其中，所述MAP4K4核心启动子核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的Overlap引物序列，其上游引物序列为：SEQ ID NO. 7所示，下游引物序列为：SEQ ID NO. 8所示。