[发明专利]一种血清胰腺癌外泌体特异蛋白及其再验证过程

权利要求书

1.一种血清胰腺癌外泌体特异蛋白，其特征在于，包括蛋白ADAM10、蛋白CFHR1、蛋白APOA4、蛋白Testicular tissue protein Li 70、蛋白HEL-S-78p、蛋白PGLYRP2、蛋白IGFALS、蛋白BCHE、蛋白ANPEP、蛋白LBP、蛋白C9、蛋白PZP、蛋白ANXA11。

2.一种根据权利要求1所述的血清胰腺癌外泌体特异蛋白的再验证过程，其特征在于，包括以下步骤：S1、分离血清样品中的无外泌体血清与外泌体；S2、采用步骤S1分离得到的外泌体，制备出外泌体PBS溶液；S3、通过透射电子显微镜来检查外泌体的超微结构；S4、通过蛋白质印迹分析来检测一些外泌体表面标志物蛋白的表达。

3.根据权利要求2所述的一种血清胰腺癌外泌体特异蛋白的再验证过程，其特征在于，所述步骤S1、分离血清样品中的无外泌体血清与外泌体，具体包括以下过程：将血清样品解冻并在4℃下以小高速离心机10000g离心30分钟，从而除去样品中的非外泌体微泡；将去除非外泌体微泡后的上清液以小高速离心机110000g离心70分钟后，将无外泌体血清分离至另一试管保存待检，外泌体沉淀重悬于4ml PBS中。

4.根据权利要求2所述的一种血清胰腺癌外泌体特异蛋白的再验证过程，其特征在于，所述步骤S2、制备出外泌体PBS溶液，具体包括以下过程：将步骤S1所得的外泌体重悬液在4℃下以小高速离心机110000g超速离心70分钟，使悬浮液中外泌体沉淀；将最终的外泌体沉淀重悬于200μl的PBS中，得到外泌体PBS溶液。

5.根据权利要求2所述的一种血清胰腺癌外泌体特异蛋白的再验证过程，其特征在于，所述步骤S4、蛋白质印迹分析来检测一些外泌体表面标志物蛋白的表达过程，包括以下步骤：(1)蛋白定量；(2)胰酶酶解；(3)液相色谱-质谱联用分析；(4)数据处理；

其中，所述步骤(1)蛋白定量的过程，使用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定；

其中，所述步骤(2)胰酶酶解，具体包括以下过程：蛋白溶液中加入二硫苏糖醇使其终浓度为5mM，56℃还原30min；之后加入碘代乙酰胺使其终浓度为11mM，室温避光孵育15min；最后将样品的尿素浓度稀释至低于2M；以胰酶：蛋白之比为1:50的质量比例加入胰酶，37℃酶解过夜；再以胰酶：蛋白之比1:100的质量比例加入胰酶，继续酶解4h；

其中，所述步骤(3)液相色谱-质谱联用分析，具体包括以下过程：a、肽段用液相色谱流动相A相溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离；流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液；液相梯度设置：0～40min，7％-25％B；40～52min，25％-35％B；52～56min，35％-80％B；56～60min，80％B，流速维持在450nL/min；b、肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进QExactiveTM Plus质谱进行分析；离子源电压设置为2.0kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析；一级质谱扫描范围设置为350～950m/z，扫描分辨率设置为70,000；二级质谱Orbitrap扫描分辨率设置为17500；c、数据采集模式使用数据非依赖型扫描程序，HCD碰撞池的碎裂能量设置为27；一级质谱自动增益控制设置为3E6，最大离子注入时间设置为50ms；二级质谱自动增益控制设置为1E5，最大离子注入时间设置为150ms，隔离窗口设置为1.6m/z；

其中，所述步骤(4)数据处理，具体包括以下过程：肽段参数：蛋白酶设置为Trypsin，最大漏切位点数设置为0，肽段长度设置为7～25个氨基酸残基，设置半胱氨酸烷基化为固定修饰；Transition参数：母离子电荷设置为2、3，子离子电荷设置为1，离子类型设置为b、y；碎片离子选择从第三个开始到最后一个，离子匹配的质量误差容忍度设置为0.02Da。