[发明专利]利用CRISPR-Cas9系统制得基因点突变动物模型胚胎的靶序列组、载体和方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用CRISPR‑Cas9系统制得基因点突变动物模型胚胎的靶序列组、载体和方法。本发明方法，包括：目标基因的sgRNA设计；Donor oligo设计；sgRNA表达质粒对的构建；体外转录；原核注射及胚胎移植。本发明方法通过对CRISPR/Cas9系统进行优化，一步获得目标基因点突变小鼠，为目标基因的研究节省时间和成本。同时也给一些致死基因的模型构建提供了一种有效的，节省时间和成本的方法。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用CRISPR-Cas9系统制备基因点突变动物模型胚胎的靶序列组、载体和方法。

背景技术

现有技术制备点突变鼠有3种方案：

一是传统ES打靶的方案，其缺点是：(1)需要复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大、耗时较长，且效率低；(2)不同品系的鼠需要不同的ES细胞，目前ES打靶做得比较多的都是常见的C57BL/6品系，其他的品系没看到有相关的报道。例如，点突变模型主要用于研究人类疾病，其经常需要用到特殊的品系，由于没有相关的ES细胞，所以无法采用ES打靶这项技术进行制备。

二是TALEN方案：其缺点是：(1)设计识别20个碱基序列的TALEN蛋白含有一千多个氨基酸，因而可能会引起机体的免疫反应，这将降低TALEN在细胞中的作用；(2)TALEN也存在脱靶的问题，这可能由于细胞中染色体的状态引起的，如TALEN技术对于处于异染色体结构中的基因序列没有效果；(3)TALEN技术是否可以胜任掺入大的片段？目前TALEN技术的应用主要集中在基因敲除方面，但是否适合大片段的基因插入还需进一步研究。最重要的是，目前较先进的ZFN/TALEN技术基于能特异性识别碱基核苷酸来构建基因打靶载体，但打靶载体的构建非常复杂，制备时间长，产生的细胞毒性大，且都不能真正做到同时完成基因组多位点的敲除。

三是CRISPR/Cas9方案。CRISPR/Cas9的方案包括两种，一种是野生型的hCas9,另一种是突变型的Cas9_D10A。野生型的hCas9的缺点：(1)容易造成脱靶效应；(2)对于一些重要基因的重要突变点容易造成致死。突变型的Cas9_D10A的缺点：(1)两种不同的sgRNA对靶位点两侧序列分别进行识别，然后结合单切口Cas9核酸酶，对两条链分别进行剪切，从而提高了靶位点识别特异性，减少了脱靶效应,但由于单切口Cas9核酸酶效率比较低，导致Cas9_D10A方案的阳性率比较低。

CRISPR/Cas9技术的基因编辑机制：CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂(DSB,double strandbreak)。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：一是低保真性的非同源末端连接途径(NHEJ，Non-homologous endjoining)，此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入(Indel)，从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变，从而制备基因敲除模式动物。CRISPR/Cas9技术的出现，使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物，且已成功应用于小鼠、大鼠、猪、灵长类、果蝇等等。第二种DNA断裂修复途径为同源介导的修复(HR,homology-directed repair)，这种基于同源重组的修复机制保真性高，但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如：条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。