[发明专利]利用CRISPR-Cas9系统制得基因点突变动物模型胚胎的靶序列组、载体和方法

权利要求书

1.一种非诊断和治疗目的地利用CRISPR-Cas9系统制备Nedd8基因点突变小鼠模型胚胎的方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤1.小鼠Nedd8基因的sgRNA设计，包括：

步骤1.1在NCBI的数据库中提取小鼠Nedd8基因ATG的上游和下游各50bp的序列，如下所示，设计靶标位点：

agcgggagaagcagcactctagccgcctgcaaccccaacctgggaagaagatgctaattaaagtgaaggtgggagcgtttccagactttccaagactcggtgc，得到包含ATG的gRNA对：

pair4-g7：ttaattagcatcttcttcccagg；

pair4-g8：gaagatgctaattaaagtgaagg；

具体序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；

步骤1.2在NCBI的数据库中提取小鼠Nedd8基因K27的上游和下游各50bp的序列，如下所示，设计靶标位点：

taattctaagcagcctctgaccacttgtttctccaaaggtggagcgaatcaaggagcgtgtggaagaaaaagaagggattcccccccagcagcagcggctcat，得到包含K27的gRNA对：

pair9-g17：tccttgattcgctccacctttgg；

pair10-g20：ggagcgaatcaaggagcgtgtgg；

具体序列如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：20所示；

步骤2.Donor oligo设计包括：

步骤2.1以Nedd8基因的N端为靶点，两端各60bp为同源臂，下划线处序列为HA序列，加粗字体序列为Flag序列，设计Donor oligo序列并合成：

Donor oligo 1：

cgaccacagcgggagaagcagcactctagccgcctgcaaccccaacctgggaagaagatgtacccatacgatgttccagattacgctgactacaaagacgatgacgacaagctaattaaagtgaaggtgggagcgtttccagactttccaagactcggtgcagggttggcc；

步骤2.2以Nedd8基因的K27为靶点，突变点K27R(AAGCGT)，两端各60bp为同源臂，下划线加粗字体为突变序列，设计Donor oligo序列并合成：

Donor oligo 2：

agtatttgtctaattctaagcagcctctgaccacttgtttctccaaaggtggagcgaatccgtgagcgtgtggaagaaaaagaagggattcccccccagcagcagcggctcatctacagtggc；

步骤3.构建可表达sgRNA的Cas9-D10A质粒；

步骤3.1合成上述包含ATG的gRNA对和包含K27的gRNA对靶序列引物：

Pair4-g7-F：caccgttaattagcatcttcttccc；

Pair4-g7-R：aaacgggaagaagatgctaattaac；

Pair4-g8-F：caccggaagatgctaattaaagtga；

Pair4-g8-R：aaactcactttaattagcatcttcc；

Pair9-g17-F：caccgtccttgattcgctccacctt；

Pair9-g17-R：aaacaaggtggagcgaatcaaggac；

Pair10-g20-F：caccgggagcgaatcaaggagcgtg；

Pair10-g20-R：aaaccacgctccttgattcgctccc；

步骤3.2将各对gRNA对靶序列上下游引物退火获得带粘性末端的双链DNA片段，连入经BbsI酶切的pX335-Bsal载体中，测序验证；

步骤4.体外转录sgRNA和Cas9-D10A mRNA；

步骤5.原核注射，包括：

将预混好的Cas9-D10A mRNA和Donor oligo序列的混合物直接注入单细胞受精卵的一细胞的胞浆内，调整合适的注射量，以溶液明显流入胞浆而不至于导致细胞死亡为止；等受精卵发育成二细胞，把预混好的sgRNA混合物直接注入二细胞中；注射后将受精卵放置在含SCR7的KSOM培养基内培养。