[发明专利]一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法

说明书

本发明涉及检测试剂技术领域，且公开了一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法，包括如下步骤：步骤一：提炼目的基因；步骤二：制备互补脱氧核糖核酸；步骤三：进行不对称的PCR扩增。该能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法，具备能快速定性检测猪瘟病毒的优点。

技术领域

本发明涉及检测试剂技术领域，具体为一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法。

背景技术

猪瘟俗称“烂肠瘟”，是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒引起的一种急性、发热、接触性传染传染病。具有高度传染性和致死性。本病在自然条件下只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和野猪都易感，一年四季均可发生。

是猪的一种急性接触性传染病，又称猪霍乱。1885年首先在美国发现，以后传播到世界各大洲。中国大部分省都有发生。1903年美国兽医学家德希尼兹和多赛特鉴定本病的病原是披盖病毒科的瘟病毒属中的猪瘟病毒。主要通过直接接触，或由于接触污染的媒介物而发病。消化道、鼻腔粘膜和破裂的皮肤均是感染途径。一年四季都可发生，以春夏多雨季节为多，人工接种的猪，一般在36～48小时后体温升高。而自然感染的潜伏期常为3～6天，间有延长到24天的。典型病例表现为最急性、亚急性或慢性病程，死亡率高。最急性型较少见，病猪体温升高，常无其他症状，1～2天内死亡。急性型最常见，体温可上升到41℃以上，食欲减退或消失，可发生眼结膜炎并有脓性分泌物，鼻腔也常流出脓性粘液，间有呕吐，有时排泄物中带血液，甚至便血。初期耳根、腹部、股内侧的皮肤常有许多点状出血或较大红点。病程一般为1～2周，最后绝大多数死亡。亚急性型常见于本病流行地区，病程可延至2～3周；有的转为慢性，常拖延1～2个月。表现粘膜苍白，眼睑有出血点。皮肤出现紫斑，病猪极度消瘦。死亡以仔猪为多，成年猪有的可以耐过。非典型病猪临诊症状不明显，呈慢性，常见于“架子猪”。剖检时急性型以出血性病变为主，常见肾皮质和膀胱粘膜中有小点出血；肠系膜淋巴结肿胀，常出现出血性肠炎，以大肠粘膜中的钮扣状溃疡为典型。

传统的猪瘟检测方法主要包括：电泳检测技术、荧光技术、结合试验技术、核酸杂交、凝胶电泳等，这些方法在病毒病诊断和进出口检验检疫中起了重要作用，但普遍存在着明显的不足，诸如检测时间长，实验过程复杂，在进行大批量检测时工作效率低，给猪瘟的检测带来巨大困难。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法，具备能快速定性检测猪瘟病毒的优点，解决了现在市面的检测试剂检测时间长，实验过程复杂，在进行大批量检测时工作效率低，给猪瘟的检测带来巨大困难的问题。

(二)技术方案

为实现能快速定性检测猪瘟病毒的目的，本发明提供如下技术方案：一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤一：提炼目的基因

S1.准备一头得了猪瘟的生猪，提炼生猪体内的PK-15细胞；

S2.将S1中得到的PK-15细胞放置在冷冻室内以零下70°的温度进行冻融12-26分钟，重复三次；

S3.提取120μlPK-15细胞和800μl的RNA裂解液放置在同一个搅拌罐内进行搅拌均匀，并且静置8-12分钟；

S4.在S3中拌匀的搅拌液中添加150μl的三氯甲烷，将其放入离心搅拌罐中以8500g/min的速度离心搅拌7-13分钟；

S5.提取S4中得到液体的上层部分，并将其放置在一个干净的试管内，并添加350μl的二甲基甲醇，静置沉淀5-8min后再放入离心搅拌罐中以8500g/min的速率离心搅拌5min；

S6.将S5中提取的液体放置在正常室温环境下自然晾干，再添加15μl DEPC处理过的水得到目标基因RNA；