[发明专利]一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法

权利要求书

1.一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一：提炼目的基因

S1.准备一头得了猪瘟的生猪，提炼生猪体内的PK-15细胞；

S2.将S1中得到的PK-15细胞放置在冷冻室内以零下70°的温度进行冻融12-26分钟，重复三次；

S3.提取120μlPK-15细胞和800μl的RNA裂解液放置在同一个搅拌罐内进行搅拌均匀，并且静置8-12分钟；

S4.在S3中拌匀的搅拌液中添加150μl的三氯甲烷，将其放入离心搅拌罐中以8500g/min的速度离心搅拌7-13分钟；

S5.提取S4中得到液体的上层部分，并将其放置在一个干净的试管内，并添加350μl的二甲基甲醇，静置沉淀5-8min后再放入离心搅拌罐中以8500g/min的速率离心搅拌5min；

S6.将S5中提取的液体放置在正常室温环境下自然晾干，再添加15μlDEPC处理过的水得到目标基因RNA；

步骤二：制备互补脱氧核糖核酸

S1.提取8μl步骤一中所得到的目标基因RNA；

S2.在其中添加3μl的反向引物和2μl的三磷酸碱基脱氧核苷酸，在45°的温度下养育3min，再快速冷却2min得到互补脱氧核糖核酸；

步骤三：进行不对称的PCR扩增

S1.提取3μl步骤二中得到的互补脱氧核糖核酸；

S2.将S1中得到的互补脱氧核糖核酸加入到80μl的不对称PCR体系中进行充分反应，先在95°的温度下预变性3min；92°的温度下变性20s，53°的温度下退火10s，70°的温度下延伸12s，重复扩增30-60次；

S4.将S2中重复扩增的产物在70°的温度下延伸8min；

S5.得到最终检测试剂。

2.根据权利要求1所述的一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法，其特征在于：所述步骤二中的反向引物的序列是5'-GCCGATTGGTCAGGATCAAAACTTATAAAAAGCATAT-3'。

3.根据权利要求1所述的一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法，其特征在于：所述步骤三中80μl不对称PCR体系的组成为：含染料2×Taq MasterMix 10μL，灭菌去离子水(ddH2O)7.7μL，正向引物和反向引物各0.15μL，DNA模板2μL，MgCl2溶液8μl(2.5mmol/L)，三磷酸碱基脱氧核苷酸溶液2μl(10mmol/L)以及余量的无菌双蒸水。