[发明专利]一种用于脂肪干细胞的冻存前处理方法

说明书

本发明涉及一种用于脂肪干细胞的冻存前处理方法：1.PBS缓冲液洗涤脂肪组织后进行第一次离心，获取中层组织，将中层组织悬浮于I型胶原酶溶液,之后进行震荡，再进行第二次离心，吸掉上清，得到二次离心细胞微球；2.将二次离心细胞微球悬浮于PBS缓冲液，之后进行过滤，取滤液得到过滤后细胞液，将过滤后细胞液中加入培养基进行重悬得到二次重悬细胞液；3.将二次重悬细胞液中的细胞接种于培养瓶中，无红细胞裂解过程；4.将培养瓶中细胞培养到第二代时，得到第二代细胞培养液，对第二代细胞培养液进行第三次离心，去掉上清后，加入冻存剂，得到终末细胞液，将终末细胞液放入慢速降温冻存盒后置于冰箱，将冰箱内的所述冻存盒转移至液氮罐保存。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种用于脂肪干细胞的冻存前处理方法。

背景技术

肪干细胞是一群从脂肪组织获取的中胚层来源的多能成体干细胞，其具有自我更新及多向分化潜能，且脂肪干细胞由于产量高，容易获取，是代替骨髓干细胞的重要干细胞来源。通过ASCs治疗慢性溃疡等临床应用已在许多临床研究中报道，此外其具有治疗糖尿病、心血管疾病、瘢痕的潜能。目前冻存脂肪干细胞的过程主要步骤分为冻存前细胞预处理、细胞与冻存剂混悬、转移入冻存管、缓慢降温，移入液氮等步骤。

然而，目前针对脂肪干细胞的冻存过程尚未标准化，细胞预处理过程尚未得到重视，其中用于冻存的细胞培养方法、细胞冻存密度尚未得到有针对性的优化。本发明专利针对脂肪干细胞冻存预处理过程进行优化，便于脂肪干细胞样本库的建立。

脂肪干细胞对于组织工程与再生医学领域具有广阔前景，针对其的研究在不断拓展与深化。研究针对脂肪干细胞提取的安全、便捷、高效具有重要作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于脂肪干细胞的冻存前处理方法，克服了现有方法中的脂肪干细胞预处理后，经冻存、复苏后细胞质量不一,本发明专利提供一种针对脂肪干细胞的冻存预处理方法，该方法较传统方法：1、冻存后细胞复苏率高；2、避免红细胞裂解过程，冻存后脂肪干细胞状态良好、稳定性良好,具有多向分化能力：3、操作方法简单易行、可重复性强。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于脂肪干细胞的冻存前处理方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：PBS缓冲液洗涤脂肪组织后进行第一次离心，获取中层组织，将所述中层组织悬浮于I型胶原酶溶液,之后进行震荡，再进行第二次离心，吸掉上清，得到二次离心细胞微球；步骤2：将所述步骤1所述二次离心细胞微球悬浮于PBS缓冲液，之后进行过滤，取滤液得到过滤后细胞液，将所述过滤后细胞液中加入培养基进行重新悬浮，得到二次重悬细胞液；步骤3：将所述步骤2中所述二次重悬细胞液中的细胞接种于培养瓶中，无红细胞裂解过程；步骤4：将所述步骤3培养瓶中细胞培养到第二代时，得到第二代细胞培养液，对所述第二代细胞培养液进行第三次离心，去掉上清后，加入冻存剂，得到终末细胞液，在室温下将所述终末细胞液放入慢速降温冻存盒后置于冰箱，最后将所述冰箱内的所述冻存盒转移至液氮罐保存。

本发明的有益效果是：克服了现有方法中的脂肪干细胞预处理后，经冻存、复苏后细胞质量不一,本发明专利提供一种针对脂肪干细胞的冻存预处理方法，该方法较传统方法：1、冻存后细胞复苏率高；2、脂肪干细胞状态良好、稳定性良好,具有多向分化能力：3、操作方法简单易行、可重复性强。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

进一步，所述步骤1中所述PBS缓冲液PH值为7-7.5，所述洗涤次数为3次，所述第一次离心速率为1200rpm,所述第一次离心时间为5min，所述I型胶原酶溶液的质量浓度为0.02％，所述I型胶原酶溶液用量与所述脂肪组织的体积相同。